鐘 越， 齊 玲， 沈 楠， 王瑋瑤， 田 晶， 王艷春

(吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

篤斯越桔(VacciniumuliginosumLinn.)是我國(guó)野生越桔的主要品種，在吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)分布最廣。篤斯越桔以富含原花青素(procyanidin，PC)著稱。研究發(fā)現(xiàn)原花青素具有抗壓力、抗氧化、抗炎癥、抗動(dòng)脈硬化、抗衰老、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能等多種生物學(xué)作用，且不良反應(yīng)低[1-3]。越桔原花青素抗腫瘤作用的研究較少，在腦膠質(zhì)瘤中的作用尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從多方面來(lái)研究越桔原花青素對(duì)腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并探討其可能的機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞株 大鼠腦膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞株由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。

1.2主要試劑 越桔原花青素(南京蘇朗醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司)；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基 (HyClone)；小牛血清和0.25%胰酶(Gibco)； MTT和DMSO(Sigma)；Bcl-2、Bax、caspase-3和β-actin抗體(北京中杉公司)。

1.3儀器 J-26XP超低溫高速離心機(jī)(貝克曼公司)；超低溫冰箱(MDF-U53V)；PLUS 384全自動(dòng)酶標(biāo)儀(MDC)；IX-70型倒置式顯微鏡(Olympus)；DNA蛋白電泳系統(tǒng)(Bio-Rad)；Image-Pro Plus 圖像分析管理系統(tǒng) (Media Cybernetics)。

2 方法

2.1C6細(xì)胞的培養(yǎng) 將C6腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液1次。

2.2越桔原花青素對(duì)C6細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，按6 000 cells/well密度將細(xì)胞接種于96孔板，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。加入不同濃度越桔原花青素(0、10、20和40 μg/L)，每個(gè)藥物濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48和72 h后棄上清，再加入MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h，棄上清后每孔加DMSO 150 μL并振蕩。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，測(cè)定各孔570 nm處的吸光度(A570) 值，細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)/A對(duì)照×100%。

2.3觀察C6細(xì)胞凋亡形態(tài) 按5 000 cells/well密度將C6細(xì)胞接種于24 孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁，加入不同濃度的越桔原花青素(0、10、20和40 μg/L)，設(shè)空白對(duì)照組。培養(yǎng)72 h，倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2.4凋亡率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞，按細(xì)胞濃度2×108/L接種于6 孔板，每孔2 mL。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組均加入越桔原花青素，使其終濃度分別為10、20和40 μg/L，空白對(duì)照組加入等體積的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h 離心收集細(xì)胞。PBS 洗滌2 次，按照說(shuō)明書操作，用1∶4 binding buffer 緩沖液190 μL 重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為(2～5)×108/L，然后加入FITC標(biāo)記的Annexin V-FITC 5 μL和20 mg/L PI 10 μL，置冰上10 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各樣品中每10 000 個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞的凋亡率。

2.5免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá) 將C6細(xì)胞按1×104cells/well密度接種于置有玻片的24孔板中，實(shí)驗(yàn)設(shè)未加藥物的對(duì)照組和越桔原花青素(10、20和40 μg/L)組，分別作用72 h后，10%甲醛溶液固定，滅活封閉，Bcl-2和Bax抗體孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育1 h，顯色、脫水、透明后封片，選擇5個(gè)不同視野，采用Image-Pro Plus分析軟件分析蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物的積分吸光度值，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.6Western blotting法檢測(cè)Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C6細(xì)胞，按細(xì)胞濃度1×108/L接種于6孔板中，每孔5 mL。實(shí)驗(yàn)組加入越桔原花青素，使其終濃度為10、20和40 μg/L，作用72 h，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細(xì)胞收至1.5 mL離心管中，離心后棄上清，PBS洗滌細(xì)胞，50 μL細(xì)胞裂解液充分裂解細(xì)胞。12 000×g、4 ℃ 離心15 min，留上清，測(cè)定樣品蛋白濃度，SDS-PAGE跑膠分離樣品，轉(zhuǎn)膜封閉，加入β-actin、Bcl-2、Bax和caspase-3 抗體，4 ℃孵育過(guò)夜。Ⅱ抗室溫孵育1 h，膠片曝光拍照。結(jié)果采用Image-Pro Plus圖像分析管理系統(tǒng)分析，以特異性條帶平均吸光度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達(dá)的水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17. 0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 越桔原花青素對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用

MTT結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞24、48和72 h，均可以明顯地抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)越桔原花青素作用于C6細(xì)胞24和48 h，40 μg/L濃度組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯地受到抑制，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；越桔原花青素作用于C6細(xì)胞72 h，20和40 μg/L濃度組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)亦明顯受抑制，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01) ,并且藥物作用具有濃度依賴性，見圖1。

Figure 1. Effects of Vaccinium vitis procyanidin on the survival rate of C6 glioma cells. Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs control group.

2 越桔原花青素抑制C6細(xì)胞生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細(xì)胞72 h，與空白對(duì)照組比較，各濃度組培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁細(xì)胞明顯減少，并且隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞密度呈下降趨勢(shì),見圖2。

3 越桔原花青素對(duì)C6細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用

10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細(xì)胞72 h后，Annexin V/PI分析各用藥組凋亡率分別為(9.98±2.75)%、(16.57±3.43)%和(17.32±3.15)%，各組凋亡率均明顯高于同期空白對(duì)照組(3.25±1.08)%，20和40 μg/L濃度組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)，且各用藥組的凋亡率隨著藥物劑量的增加而顯著升高,見圖3。

Figure 2. Vaccinium vitis procyanidin inhibited the growth of C6 cells observed under inverted microscope (×200).A：control group; B：10 μg/L group; C：20 μg/L group; D： 40 μg/L group.

Figure 3. Effects of Vaccinium vitis procyanidin on apoptosis of C6 glioma cells.

4 C6細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細(xì)胞72 h后，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞表達(dá)Bcl-2蛋白隨著藥物濃度升高而減少，而表達(dá)Bax蛋白增加，但均無(wú)明顯差異。計(jì)算Bax/Bcl-2比值發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度升高，兩者的比值明顯升高，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且具有明顯的劑量依賴性，見圖4。

Figure 4. The changes of Bcl-2 and Bax protein expression in C6 cells after treated with Vaccinium vitis procyanidin (PC)(×200). Mean±SD.n=3.*P<0.05, **P<0.01 vs 0 μg/L group.

5 Western blotting結(jié)果

Western blotting結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞72 h后，細(xì)胞表達(dá)Bcl-2蛋白減少，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，并隨著藥物濃度升高，表達(dá)量逐漸減少；細(xì)胞表達(dá)Bax蛋白也增加，與對(duì)照組比較，各藥物組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)caspase-3蛋白發(fā)現(xiàn)，各藥物組細(xì)胞表達(dá)均增加，與空白對(duì)照組比較，20 μg/L越桔原花青素組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。計(jì)算Bax/Bcl-2結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，各藥物組細(xì)胞的Bax/Bcl-2均明顯增加(P<0.01)，見圖5。

討 論

2007年北京市首次發(fā)布《全市健康狀況白皮書》指出，惡性腫瘤第1次位居疾病死亡原因首位。而腦腫瘤由于其地位的特殊性，成為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病之一。腦腫瘤大多數(shù)為膠質(zhì)瘤，且以惡性居多[4]，包括替莫唑胺在內(nèi)的多種療法對(duì)于患者生存期延長(zhǎng)的意義不大[5]。有研究表明，這是由于在腫瘤發(fā)生過(guò)程中激活了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)途徑和/或抑制了腫瘤細(xì)胞的凋亡途徑[6-8]。

腫瘤細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中由于凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)障礙，使它具有極強(qiáng)的生長(zhǎng)能力。Bcl-2家族成員是腫瘤凋亡研究的熱點(diǎn)，研究表明，在線粒體膜上Bcl-2蛋白增多就會(huì)阻斷Bax等促凋亡蛋白的誘導(dǎo)凋亡作用，當(dāng)降低Bcl-2蛋白表達(dá)時(shí)就會(huì)消除這種阻遏作用，使Bax等激活，線粒體膜上大孔通道開放，從而線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C等蛋白釋放，促使凋亡發(fā)生[9-10]。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)Bax/Bcl-2的比值增加也會(huì)引起腫瘤細(xì)胞凋亡[11]。在凋亡途徑中，caspase-3是效應(yīng)因子，是凋亡的執(zhí)行者，當(dāng)線粒體蛋白釋放后就會(huì)使caspase-3活化裂解，使凋亡得以進(jìn)行[12]。

本實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度的越桔原花青素對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，MTT結(jié)果顯示，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用24、48和72 h，均可以明顯地抑制C6細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且隨著藥物濃度的升高，細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制更加明顯；如果增加藥物作用的時(shí)間，也可以增加細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用(圖1)。當(dāng)在倒置顯微鏡下觀察10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細(xì)胞72 h，與空白對(duì)照組比較，各藥物組細(xì)胞的密度隨著藥物濃度的升高而降低(圖2)。以上這些結(jié)果提示，越桔原花青素可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，且這種作用具有劑量依賴性。流式分析術(shù)分析其凋亡率發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)球的凋亡率亦隨著藥物濃度的增加而明顯增加，也呈現(xiàn)明顯的劑量效應(yīng)(圖3)。這說(shuō)明越桔原花青素可能誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，但機(jī)制不清。

為了研究誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡使生長(zhǎng)受抑制的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究Bcl-2、Bax和caspase-3等相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，細(xì)胞免疫組化和Western blotting結(jié)果表明，10、20和40 μg/L越桔原花青素作用于C6細(xì)胞72 h后，細(xì)胞表達(dá)Bcl-2蛋白減少而表達(dá)Bax蛋白增加，Bax/Bcl-2的比值隨著藥物濃度升高而升高，并且細(xì)胞表達(dá)Bcl-2蛋白減少呈現(xiàn)濃度依賴性(圖4、5)。進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)caspase-3蛋白發(fā)現(xiàn)，各藥物組細(xì)胞表達(dá)caspase-3蛋白均增加，與空白對(duì)照組比較，20 μg/L越桔原花青素組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。并且由于越桔原花青素作用于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞后，通過(guò)線粒體路徑促使凋亡發(fā)生過(guò)程中，caspase-3活化是凋亡的下游事件，所以可能導(dǎo)致Bax/Bcl-2的結(jié)果與之不完全平行。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，越桔原花青素可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且通過(guò)上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)、下調(diào)Bcl-2表達(dá)，使Bax/Bcl-2的比值升高，增加促凋亡因素，最后促進(jìn)下游效應(yīng)因子caspase-3的活化增加，從而使腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究顯示，從葡萄籽中提取出來(lái)的原花青素低聚物雖可以使U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡，但其主要不是通過(guò)凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的[13]，所以在越桔原花青素抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中是否有其它作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Zhao BX, Sun YB, Wang SQ, et al. Grape seed procyanidin reversal of p-glycoprotein associated multi-drug resistance via down-regulation of NF-κB and MAPK/ERK mediated YB-1 activity in A2780/T cells[J]. PLoS One, 2013, 8(8):e71071.

[2] 范紅艷, 王艷春, 任 曠, 等. 越桔原花青素對(duì)大鼠心肌纖維化作用的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2009, 25(5): 626-630.

[3] 范紅艷, 王艷春, 任 曠, 等. 越桔原花青素對(duì)異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化的抑制作用及機(jī)制[J]. 中國(guó)中藥雜志, 2012, 37(3):344-347.

[4] Stupp R, Warren P, Martin J, et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma[J]. N Engl J Med, 2005, 352(10): 987-996.

[5] Sathornsumetee S, Reardon DA, Desjardins A, et al. Molecularly targeted therapy for malignant glioma[J]. Can-cer, 2007, 110(1): 13-24.

[6] Giese A, Bjerkvig R, Berens ME, et al. Cost of migration: invasion of malignant gliomas and implications for treatment[J]. J Clin Oncol, 2003, 21(8): 1624-1636.

[7] Lefranc F, Brotchi J, Kiss R. Possible future issues in the treatment of glioblastomas: special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells to apoptosis[J]. J Clin Oncol, 2005, 23(10): 2411-2422.

[8] Qi L, Bellail AC, Rossi MR, et al. Heterogeneity of primary glioblastoma cells in the expression of caspase-8 and the response to TRAIL-induced apoptosis[J]. Apoptosis, 2011, 16(11): 1150-1164.

[9] Bellail AC, Qi L, Mulligan P, et al. TRAIL agonists on clinical trials for cancer therapy: the promises and the challenges[J]. Rev Recent Clin Trials, 2009, 4(1):34-41.

[10] 李 軍, 王國(guó)榮, 張秀芹, 等. 二苯乙烯苷對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及bcl-2、bax、caspase-3 表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2013,29(4):743-747.

[11] 焦俊霞, 高維娟, 李玉明, 等. 黃芪注射液對(duì)缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖大鼠海馬神經(jīng)元Bcl-2 和Bax 表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011,27(5):905-910.

[12] Deng Y, Lin Y, Wu X. TRAIL-induced apoptosis requires Bax-dependent mitochondrial release of Smac/DIABLO[J]. Genes Dev, 2002, 16(1): 33-45.

[13] Zhang FJ, Yang JY, Mou YH, et al. Oligomer procyanidins from grape seeds induce a paraptosis-like programmed cell death in human glioblastoma U-87 cells[J]. Pharm Biol, 2010, 48(8):883-890.