劉巖+孫嵐+姚紅娟+張英鴿

（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京100850）

[摘要]目的：制備γ環(huán)糊精-C60超分子化合物，改善C60的水溶性和血液相容性。方法：采用研磨法制備γ環(huán)糊精-C60超分子化合物，利用紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，通過(guò)溶血實(shí)驗(yàn)及血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)對(duì)C60、γ環(huán)糊精-C60的血液相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：紅外光譜結(jié)果表明γ環(huán)糊精與C60發(fā)生包埋，γ環(huán)糊精-C60在雙蒸水中放置24h無(wú)聚沉，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時(shí)，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02±0.12%、3.21±0.19%，γ環(huán)糊精-C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%；陽(yáng)性對(duì)照、C60、γ環(huán)糊精-C60的復(fù)鈣時(shí)間分別為10min 、15min、20min，對(duì)應(yīng)吸光度值分別為1.09、0.68、0.51 。結(jié)論：經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的水溶性和血液相容性得到改善。

[關(guān)鍵詞]C60；γ環(huán)糊精；水溶性；血液相容性

中圖分類號(hào)：O657文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：2095-5200（2014）04-001-03

DOI：10.11876/mimt201404001

Preparation of water-soluble fullerene C60 and its hemocompatibility studyLIU Yan，SUN lan，YAO Hong-juan，ZHANG Ying-ge.（Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850）

[Abstract]Objective：To improve the water-solubility of C60, γ cyclodextrin-C60 supramolecular compounds were prepared. Methods：γ cyclodextrin-C60 supramolecular compounds were prepared by grinding way. The structure of γ cyclodextrin-C60 was characterized by infrared spectroscopy. Then, through the hemolysis experiment and plasma recalcification experiment, the hemocompatibility of C60 and γ cyclodextrin-C60 have been evaluated. Results：FTIR results showed that the γ cyclodextrin embedded with C60. γ cyclodextrin-C60 placed 24h without coagulation in double distilled water. In the concentration of 512μg/mL, 102.4μg/mL, 25.6μg/mL the hemolysis rate of C60 were 13.75% ± 0.26%, 6.02 ± 0.12%, 3.21 ± 0.19% respectively, while γ cyclodextrin-C60 were 3.74% ± 0.39%, 1.13% ± 0.12%, 0.55% ± 0.19% respectively. Recalcification time of positive control, C60 and γ cyclodextrin-C60 was 10min, 15min, 20min and the corresponding absorbance values were 1.09,0.68,0.51. Conclusion：γ cyclodextrin modification can improve water-solubility and hemocompatibility of C60.

[Key words]C60；γ cyclodextrin；water-solubility；hemocompatibility1985年Kroto等首次發(fā)現(xiàn)了碳的第三種同素異形體富勒烯C60 [1]，1990年Kr?tschmer采用石墨電弧放電的方法分離出了克量級(jí)C60，使得C60的研究迅速發(fā)展起來(lái)[2]。近年來(lái)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)C60具有良好的醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景，如可以作為藥物載體[3]、抗艾滋病藥物[4]、光動(dòng)力學(xué)殺傷腫瘤藥物[5]、X射線對(duì)照劑[6]等。但C60的理化性質(zhì)表現(xiàn)出高度疏水性和不良的血液相容性，使其發(fā)展受到限制。為改善C60的水溶性和血液相容性，可以對(duì)C60進(jìn)行功能化修飾，通過(guò)引入羥基、羧基等極性官能團(tuán)來(lái)提高C60的親水性和減少血漿蛋白的黏附。本研究采用研磨法制備γ環(huán)糊精- C60超分子化合物，并對(duì)其水溶性和血液相容性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1儀器與試劑

C-120S精密電子分析天平（Sartorius，德國(guó)），行星式高能球磨機(jī)（P7型，德國(guó)），離心機(jī)（TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠），旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器（DSHZ-300A，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠），紅外光譜儀（Bruker Vertex 70，德國(guó)）C60（濮陽(yáng)市永新富勒烯科技有限公司，純度99.9%），γ環(huán)糊精（damas-beta，瑞士），0.9%氯化鈉注射液（石家莊四藥集團(tuán)），氯化鈣（北京化學(xué)試劑公司，純度≥95%），成人全血（中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所提供）。

2實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1C60的修飾改性

2.1.1γ環(huán)糊精- C60超分子化合物制備稱取54mgγ環(huán)糊精與25mg C60以800 r/mim研磨4h，收集研磨產(chǎn)物于錐形瓶中，加入20mL雙蒸水，置于恒溫振蕩器搖振30min（溫度：37℃、轉(zhuǎn)速：100 r/min），將混懸液以16000 r/min離心5min，棄下層沉淀，上清液在-20℃冷凍8h后，放入凍干機(jī)中干燥。

2.1.2C60與γ環(huán)糊精- C60的水溶性C60/雙蒸水、γ環(huán)糊精- C60/雙蒸水樣品放置24h后，C60產(chǎn)生聚沉，微溶于水，γ環(huán)糊精- C60仍能保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)，無(wú)沉淀析出，如圖1所示。

圖1C60（左）與γ環(huán)糊精-C60（右）在水中的溶解性

2.2結(jié)構(gòu)表征

采用溴化鉀壓片法測(cè)定C60、γ環(huán)糊精、γ環(huán)糊精- C60的紅外光譜，譜圖結(jié)果如圖2所示。

γ環(huán)糊精和C60的紅外測(cè)定結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[7-8]。在γ環(huán)糊精-C60的紅外光譜中：1427.6、575.8、526.3cm-1處為C60的特征吸收峰，3401.7、2925.3、1155.4、756.1、704.6 cm-1處為γ環(huán)糊精的特征吸收峰，說(shuō)明γ環(huán)糊精與C60發(fā)生了包埋。

2.3溶血率測(cè)定

（1）將8 mL成人全血用10 mL 生理鹽水稀釋。（2）分別稱取6.4 mg C60和γ環(huán)糊精- C60，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL、102.4μg/mL、25.6μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min，向各樣品中加入0.2 mL（1）中所配稀釋血液，輕輕搖勻后于37℃放置60 min，以1500 r/min離心10 min，吸取上清液0.1 mL加入到96孔板中。（3）配制陽(yáng)性對(duì)照樣品：0.2 mL稀釋血液與10 mL超純水混勻；配制陰性對(duì)照樣品：0.2 mL稀釋血液與10 mL 生理鹽水混勻；將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照樣品以0.1 mL/孔加入到96孔板中。（4）在545nm處測(cè)定吸光度值。溶血率測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

溶血率（%）=（測(cè)試樣吸光度值-陰性對(duì)照吸光度值）/（陽(yáng)性對(duì)照吸光度值-測(cè)試樣吸光度值）

由圖3可知，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時(shí)，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ環(huán)糊精- C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。結(jié)果表明C60經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后溶血率降低。

2.4血漿復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定

（1）以1000 r/min將成人全血離心10 min，棄下層血小板，得到去血小板血漿；（2）稱取30 mg氯化鈣，用雙蒸水溶解，配制濃度為0.025mol/L的氯化鈣水溶液；（3）稱取C60和γ環(huán)糊精- C60各6.4 mg，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血漿、0.025 mol/L的氯化鈣水溶液和待測(cè)樣品各100μL，在405nm處測(cè)定復(fù)鈣時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線，間隔5 min采樣一次；（5）陽(yáng)性對(duì)照組采用100μL去血小板血漿加100μL 0.025 mol/L的氯化鈣水溶液，陰性對(duì)照組采用100μL去血小板血漿。

圖4血漿復(fù)鈣動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照組、C60、γ環(huán)糊精- C60復(fù)鈣時(shí)間分別為10min、15min、20min，對(duì)應(yīng)的吸光度值分別為1.09、0.68、0.51，說(shuō)明C60經(jīng)環(huán)糊精修飾后復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)，生成沉淀減少。

圖 4血漿復(fù)鈣時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線

3討論

γ環(huán)糊精是一種內(nèi)腔疏水外緣親水的兩親型化合物，其分子內(nèi)空腔表面僅存在糖苷氧原子及覆蓋糖苷氧原子的氫原子而表現(xiàn)出疏水性，空腔尺寸為0.9-1nm大于C60的結(jié)構(gòu)尺寸，可以通過(guò)疏水作用對(duì)C60進(jìn)行包埋形成超分子化合物，這種超分子化合物因γ環(huán)糊精外緣含有豐富的羥基而具有良好的水溶性，是一種提高C60水溶性的有效途徑。

溶血實(shí)驗(yàn)是考察受試材料的血液相容性，評(píng)價(jià)其對(duì)紅細(xì)胞損害程度的一種方法。當(dāng)材料與血液接觸后可引起血紅蛋白變性從而導(dǎo)致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ環(huán)糊精對(duì)C60修飾后，各劑量組的溶血率均下降，達(dá)到了美國(guó)材料試驗(yàn)協(xié)會(huì)（ASTM）認(rèn)可的溶血率低于5%的良好血液相容性標(biāo)準(zhǔn)。血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)，生成沉淀減少，說(shuō)明抗凝血性得到了提高。這主要是因?yàn)棣铆h(huán)糊精外緣含有大量羥基而帶有負(fù)電，可以與同樣帶有負(fù)電荷的血漿蛋白產(chǎn)生排斥從而減少血漿蛋白的粘附。綜上所述，采用γ環(huán)糊精對(duì)C60進(jìn)行修飾可以增強(qiáng)其水溶性，改善其血液相容性，為C60在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]Kroto H W, Heath J R, óBrien S C, et al. C60 : Buckminsterfullerene[J]. Nature, 1985, 318: 162-172.

[2]Kr?tschmer W, Lamb L D, Fostiro poulos K, et al. Solid C60: A new form of carbon[J]. Nature, 1990, 347( 27) : 354.

[3]Jinjin Shi, Yan Liu, Lei Wang, et al. A tumoral acidic pH-responsive drug delivery system based on a novel photosensitizer (fullerene) for in vitro and in vivo chemo-photodynamic therapy[J]. Acta Biomaterialia, 2014, 10(3):1280-1291.

[4]Friedman S H, De Camp D L, sijbesma R P, et al. Inhibition of the HIV-1protease by : fullerene derivatives: model building studies and experimental verification[J]. Am. Chem. Soc., 1993, 115: 6506-6509.

[5]Hidetoshi, Tikuyama, Shigeru, et al. Photoinduced biochemical activity of fullerene carboxylic acid[J]. Am. Chem. Soc.,1993, 115(17): 7918-7919.

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[7]胡全利，禹金強(qiáng)，李村娟，等. C60材料紅外和拉曼特性[J]. 東北大學(xué)學(xué)報(bào)，1996,17(5): 541-543.

[8]劉鳳萍. β-環(huán)糊精交聯(lián)聚合物的合成及紅外光譜研究[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2002,19(4): 505-507.

溶血率（%）=（測(cè)試樣吸光度值-陰性對(duì)照吸光度值）/（陽(yáng)性對(duì)照吸光度值-測(cè)試樣吸光度值）

由圖3可知，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時(shí)，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ環(huán)糊精- C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。結(jié)果表明C60經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后溶血率降低。

2.4血漿復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定

（1）以1000 r/min將成人全血離心10 min，棄下層血小板，得到去血小板血漿；（2）稱取30 mg氯化鈣，用雙蒸水溶解，配制濃度為0.025mol/L的氯化鈣水溶液；（3）稱取C60和γ環(huán)糊精- C60各6.4 mg，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血漿、0.025 mol/L的氯化鈣水溶液和待測(cè)樣品各100μL，在405nm處測(cè)定復(fù)鈣時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線，間隔5 min采樣一次；（5）陽(yáng)性對(duì)照組采用100μL去血小板血漿加100μL 0.025 mol/L的氯化鈣水溶液，陰性對(duì)照組采用100μL去血小板血漿。

圖4血漿復(fù)鈣動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照組、C60、γ環(huán)糊精- C60復(fù)鈣時(shí)間分別為10min、15min、20min，對(duì)應(yīng)的吸光度值分別為1.09、0.68、0.51，說(shuō)明C60經(jīng)環(huán)糊精修飾后復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)，生成沉淀減少。

圖 4血漿復(fù)鈣時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線

3討論

γ環(huán)糊精是一種內(nèi)腔疏水外緣親水的兩親型化合物，其分子內(nèi)空腔表面僅存在糖苷氧原子及覆蓋糖苷氧原子的氫原子而表現(xiàn)出疏水性，空腔尺寸為0.9-1nm大于C60的結(jié)構(gòu)尺寸，可以通過(guò)疏水作用對(duì)C60進(jìn)行包埋形成超分子化合物，這種超分子化合物因γ環(huán)糊精外緣含有豐富的羥基而具有良好的水溶性，是一種提高C60水溶性的有效途徑。

溶血實(shí)驗(yàn)是考察受試材料的血液相容性，評(píng)價(jià)其對(duì)紅細(xì)胞損害程度的一種方法。當(dāng)材料與血液接觸后可引起血紅蛋白變性從而導(dǎo)致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ環(huán)糊精對(duì)C60修飾后，各劑量組的溶血率均下降，達(dá)到了美國(guó)材料試驗(yàn)協(xié)會(huì)（ASTM）認(rèn)可的溶血率低于5%的良好血液相容性標(biāo)準(zhǔn)。血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)，生成沉淀減少，說(shuō)明抗凝血性得到了提高。這主要是因?yàn)棣铆h(huán)糊精外緣含有大量羥基而帶有負(fù)電，可以與同樣帶有負(fù)電荷的血漿蛋白產(chǎn)生排斥從而減少血漿蛋白的粘附。綜上所述，采用γ環(huán)糊精對(duì)C60進(jìn)行修飾可以增強(qiáng)其水溶性，改善其血液相容性，為C60在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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[8]劉鳳萍. β-環(huán)糊精交聯(lián)聚合物的合成及紅外光譜研究[J]. 光譜實(shí)驗(yàn)室，2002,19(4): 505-507.

溶血率（%）=（測(cè)試樣吸光度值-陰性對(duì)照吸光度值）/（陽(yáng)性對(duì)照吸光度值-測(cè)試樣吸光度值）

由圖3可知，樣品濃度為512μg/mL 、102.4μg/mL 、25.6μg/mL時(shí)，C60的溶血率分別為13.75%±0.26%、6.02%±0.12%、3.21%±0.19%，γ環(huán)糊精- C60的溶血率分別為3.74%±0.39%、1.13%±0.12%、0.55%±0.19%。結(jié)果表明C60經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后溶血率降低。

2.4血漿復(fù)鈣時(shí)間測(cè)定

（1）以1000 r/min將成人全血離心10 min，棄下層血小板，得到去血小板血漿；（2）稱取30 mg氯化鈣，用雙蒸水溶解，配制濃度為0.025mol/L的氯化鈣水溶液；（3）稱取C60和γ環(huán)糊精- C60各6.4 mg，用生理鹽水配制成濃度為512μg/mL的樣品，于37℃恒溫放置30 min；（4）向96孔板各孔中加入去血小板血漿、0.025 mol/L的氯化鈣水溶液和待測(cè)樣品各100μL，在405nm處測(cè)定復(fù)鈣時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線，間隔5 min采樣一次；（5）陽(yáng)性對(duì)照組采用100μL去血小板血漿加100μL 0.025 mol/L的氯化鈣水溶液，陰性對(duì)照組采用100μL去血小板血漿。

圖4血漿復(fù)鈣動(dòng)力學(xué)曲線的測(cè)定結(jié)果顯示：陽(yáng)性對(duì)照組、C60、γ環(huán)糊精- C60復(fù)鈣時(shí)間分別為10min、15min、20min，對(duì)應(yīng)的吸光度值分別為1.09、0.68、0.51，說(shuō)明C60經(jīng)環(huán)糊精修飾后復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)，生成沉淀減少。

圖 4血漿復(fù)鈣時(shí)間動(dòng)力學(xué)曲線

3討論

γ環(huán)糊精是一種內(nèi)腔疏水外緣親水的兩親型化合物，其分子內(nèi)空腔表面僅存在糖苷氧原子及覆蓋糖苷氧原子的氫原子而表現(xiàn)出疏水性，空腔尺寸為0.9-1nm大于C60的結(jié)構(gòu)尺寸，可以通過(guò)疏水作用對(duì)C60進(jìn)行包埋形成超分子化合物，這種超分子化合物因γ環(huán)糊精外緣含有豐富的羥基而具有良好的水溶性，是一種提高C60水溶性的有效途徑。

溶血實(shí)驗(yàn)是考察受試材料的血液相容性，評(píng)價(jià)其對(duì)紅細(xì)胞損害程度的一種方法。當(dāng)材料與血液接觸后可引起血紅蛋白變性從而導(dǎo)致血液凝固和血栓的形成，溶血率越低表明材料的血液相容性越好。采用γ環(huán)糊精對(duì)C60修飾后，各劑量組的溶血率均下降，達(dá)到了美國(guó)材料試驗(yàn)協(xié)會(huì)（ASTM）認(rèn)可的溶血率低于5%的良好血液相容性標(biāo)準(zhǔn)。血漿復(fù)鈣實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示經(jīng)γ環(huán)糊精修飾后C60的復(fù)鈣時(shí)間延長(zhǎng)，生成沉淀減少，說(shuō)明抗凝血性得到了提高。這主要是因?yàn)棣铆h(huán)糊精外緣含有大量羥基而帶有負(fù)電，可以與同樣帶有負(fù)電荷的血漿蛋白產(chǎn)生排斥從而減少血漿蛋白的粘附。綜上所述，采用γ環(huán)糊精對(duì)C60進(jìn)行修飾可以增強(qiáng)其水溶性，改善其血液相容性，為C60在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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