郭云霞 李紹旦 劉毅 楊明會(huì)

·論著·

補(bǔ)腎活血顆粒對(duì)帕金森大鼠腦腺苷A2A受體影響的研究

郭云霞 李紹旦 劉毅 楊明會(huì)

目的探討補(bǔ)腎活血顆粒治療帕金森病的作用機(jī)制。方法用6-羥基多巴損毀腦右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束的方法建立帕金森大鼠模型。將33只SD模型大鼠隨機(jī)分為治療組18只和對(duì)照組15只，另設(shè)正常組15只，治療組以中藥補(bǔ)腎活血顆粒灌胃每日1次，連續(xù)8周。對(duì)照組及正常組同法以生理鹽水灌胃8周，灌胃結(jié)束、觀察帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為變化，后斷頭取腦，免疫熒光法觀察大鼠腦腺苷A2A受體變化。結(jié)果治療組大鼠旋轉(zhuǎn)行為較對(duì)照組改善，治療組大鼠腦紋狀體A2A受體表達(dá)較對(duì)照組明顯減弱(P<0.01)，模型組比正常組表達(dá)顯著增強(qiáng)(P<0.01)。三組大鼠黑質(zhì)中A2A受體均無(wú)表達(dá)。結(jié)論補(bǔ)腎活血顆粒能改善帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為，抑制大鼠紋狀體腺苷A2A受體表達(dá)，對(duì)帕金森病治療起到較好療效。

補(bǔ)腎活血顆粒； 帕金森模型大鼠； 腺苷A2A受體

帕金森病(parkinsons disease，PD)是中老年常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元變性丟失，紋狀體多巴胺水平下降，發(fā)病機(jī)制尚不明確。主要治療藥物為左旋多巴制劑，長(zhǎng)期應(yīng)用后存在藥效下降或失效，出現(xiàn)不同程度的副作用。中藥在PD治療上有一定優(yōu)勢(shì)，補(bǔ)腎活血顆粒是楊明會(huì)教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)方，課題組通過制作帕金森大鼠動(dòng)物模型，給予補(bǔ)腎活血顆粒干預(yù)后，觀察帕金森大鼠旋轉(zhuǎn)行為及大鼠腦腺苷A2A受體變化，探討補(bǔ)腎活血顆粒治療帕金森病的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)Sprague-Dawle(SD)雄性大鼠80只，體重190～210g左右，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001。

1.2 藥物與試劑

補(bǔ)腎活血顆粒由山茱萸20 g、肉蓯蓉10 g、何首烏15 g、川芎10 g、當(dāng)歸10 g、丹參15 g、蜈蚣2條等組成，解放軍總醫(yī)院、全軍中醫(yī)研究所統(tǒng)一制成中藥顆粒沖劑，規(guī)格為一袋8 g，產(chǎn)品批號(hào)100101。

6%水合氯醛(北京化學(xué)試劑公司)，6-羥多巴(6-OHDA)(美國(guó)sigma公司)，阿樸嗎啡(沈陽(yáng)第一制藥廠)。

1.3 儀器

大鼠腦立體定位儀(美國(guó)KOPF公司)，帕金森動(dòng)物旋轉(zhuǎn)檢測(cè)儀(美國(guó)columbus instruments公司)微量注射泵，牙科鉆，外科手術(shù)器械，電子天平，超凈工作臺(tái)。

1.4 模型制備

80只大鼠隨機(jī)分為2組，模型組65只，正常組15只，模型組隨機(jī)分為造模組50只，假手術(shù)組15只，適應(yīng)環(huán)境、正常飼養(yǎng)2周，行為學(xué)測(cè)試無(wú)旋轉(zhuǎn)行為后造模。術(shù)前12小時(shí)禁食，按照動(dòng)物使用的3R原則[1]予人道關(guān)懷，稱重，6%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔內(nèi)注射，麻醉后，俯臥位固定于腦立體定位儀上，頭部消毒，沿正中矢狀線暴露顱骨，調(diào)整門齒桿，使前后囟位于同一水平面上，按照包氏大鼠立體定位圖譜[2]定位右側(cè)內(nèi)側(cè)前腦束(MFB)，于前囟后4.3 mm，矢狀線右旁開1.5 mm，進(jìn)針深度7.6 mm，牙科鉆鉆透顱骨，微量注射泵吸取6-hydroxydopamine(6-OHDA)8 μl，注射速度為1 μl/min，每次注射后留針5分鐘，緩慢出針，縫合頭皮。假手術(shù)組以等量生理鹽水進(jìn)行上述操作，正常組不做任何處理。

術(shù)后2周進(jìn)行旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試，給大鼠穿上束縛套后置于旋轉(zhuǎn)檢測(cè)儀中適應(yīng)5分鐘，大鼠安靜后皮下注射阿樸嗎啡(0.5 mg/kg)，5分鐘后由旋轉(zhuǎn)檢測(cè)儀統(tǒng)一記錄旋轉(zhuǎn)次數(shù)，設(shè)定記錄時(shí)間為30分鐘。如大鼠恒定轉(zhuǎn)向左側(cè)，如旋轉(zhuǎn)數(shù)﹥210轉(zhuǎn)/30分，則為成功的帕金森大鼠模型。

1.5 模型分組與給藥

造模成功33只帕金森大鼠隨機(jī)分為治療組(補(bǔ)腎活血顆粒)18只、對(duì)照組15只，同設(shè)正常組15只,按照大鼠與人的藥物劑量換算公式，大鼠每公斤體重給藥量按成人(60 kg)每公斤劑量的10倍計(jì)算[3]溶于生理鹽水中，灌胃法給藥，給藥時(shí)間上午9∶00～10∶00，每天一次，每周稱重一次，調(diào)整給藥量，連續(xù)8周，對(duì)照組、正常組同樣方法給予等量生理鹽水灌胃。

1.6 取材及處理

將模型組及正常大鼠迅速斷頭取腦，將腦組織平放入放有錫紙的托盤中，托盤平放到液氮表面，將組織迅速冷凍，取出組織放至置于-80℃冰箱保存，冰凍切片機(jī)中切片,厚度約10 μm,冰凍切片丙酮固定2分鐘，磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)洗3次，每次5分鐘。含5%羊血清的抗體稀釋液在37°C封閉30分鐘。棄液不洗,按1/100比例加入一抗，4°C過夜。PBS洗3次，每次5分鐘，加入熒光標(biāo)記的羊抗兔二抗，室溫反應(yīng)1小時(shí)。PBS洗3次，每次5分鐘。DAPI復(fù)染細(xì)胞核。PBS洗3次，每次3分鐘。甘油封片。顯微鏡觀察并照相。

1.7 觀測(cè)指標(biāo)

旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試：灌胃結(jié)束后進(jìn)行，方法同造模中旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試。

腺苷A2A受體表達(dá)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及熒光表達(dá)，紋狀體部位取5張切片，在200倍電鏡視野下計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，把不同部位視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)相加后取平均數(shù)，就是每張切片的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 旋轉(zhuǎn)行為測(cè)試

治療后治療組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)與治療前比較明顯下降(P<0.01)，治療后對(duì)照組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)與治療前比較無(wú)明顯變化(P>0.05)，治療后治療組大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)較對(duì)照組明顯下降(P<0.01),見表1。

表1 兩組帕金森大鼠治療前后轉(zhuǎn)數(shù)

注：與治療前比較，aP<0.01；與對(duì)照組比較，bP<0.01

2.2 大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

治療組及對(duì)照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞均較正常組升高(P<0.01)，治療后治療組大鼠紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，見表2。

表2 紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

注：與正常組比較,aP<0.01;與對(duì)照組比較,bP<0.01

2.3大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達(dá)免疫熒光圖像

免疫熒光結(jié)果顯示在大鼠腦紋狀體部位，腺苷A2A受體在電鏡下觀察其染色呈紅色，主要表達(dá)于細(xì)胞核。正常組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目偏少、染色偏淡，見圖1；對(duì)照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目偏多、染色深，見圖2；對(duì)照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目居于正常組與對(duì)照組之間，見圖3。

圖1 正常大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達(dá)圖像(電鏡，×20)

圖2 對(duì)照組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達(dá)圖像(電鏡，×20)

圖3 治療組大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達(dá)圖像(電鏡，×20)

3 討論

帕金森病發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，為了更好研究其發(fā)病機(jī)制，研發(fā)有效治療藥物，觀察藥物的安全性及有效性，需要建立能夠模擬人類帕金森病的動(dòng)物模型。其中6-羥多巴損毀法(將6-羥多巴局部定向注射到黑質(zhì)或紋狀體等部位，損傷黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元通路)制備帕金森病大鼠模型，在病理和生理及行為學(xué)上與人類帕金森病有許多相似之處，且經(jīng)濟(jì)、方便、成功率高、穩(wěn)定可靠，能夠?qū)⒍喟桶肥荏w激動(dòng)劑(阿撲嗎啡)誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為進(jìn)行量化而被廣泛應(yīng)用。

帕金森病屬于中醫(yī)“顫證”范疇，其病機(jī)在古籍文獻(xiàn)中最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“諸風(fēng)掉眩皆屬于肝”，金元之前多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為是“外風(fēng)”為患，之后眾多醫(yī)家多以“內(nèi)風(fēng)”立論，明清后認(rèn)為風(fēng)、火、痰、瘀是主要病因，與肝、脾、腎等臟腑，尤其是肝密切相關(guān)。現(xiàn)代多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為肝腎虧虛，氣血不足為本，風(fēng)火痰瘀為標(biāo)，為本虛標(biāo)實(shí)之證。楊明會(huì)教授在多年的臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上提出PD的腎虛血瘀之說(shuō)，以補(bǔ)腎活血法治療PD，經(jīng)反復(fù)優(yōu)化篩選創(chuàng)建的中藥復(fù)方補(bǔ)腎活血顆粒，由山茱萸、肉蓯蓉、何首烏、川芎、當(dāng)歸、丹參、蜈蚣等組成，山茱萸、肉蓯蓉、何首烏有補(bǔ)腎健腦之效，川芎、當(dāng)歸、丹參具有養(yǎng)血活血通絡(luò)之功，蜈蚣其走竄之力最速，內(nèi)達(dá)臟腑，外至經(jīng)絡(luò)，凡氣血凝聚之處皆能開之，全方標(biāo)本兼治，共奏補(bǔ)腎活血之功。

腺苷是內(nèi)源性嘌呤核苷，目前已知4種腺苷受體(A1、A2A、A2B、A3)，屬G蛋白偶聯(lián)受體家族[4]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中在紋狀體含量最豐富，其它區(qū)域表達(dá)水平很低[5]。腺苷A2A受體與多巴胺D2受體共同表達(dá)于紋狀體—蒼白球的中間棘狀神經(jīng)元[6]，伏隔核的核心區(qū)及嗅結(jié)節(jié)[7]，兩者形成異源二聚體和/或異源低聚體，此二聚體可降低多巴胺D2受體的活性，阻斷多巴胺D2受體與G蛋白偶聯(lián)，在第二信使水平二者互相拮抗[8]。紋狀體中傳出神經(jīng)元至少受γ-氨基丁酸和乙酰膽堿兩種神經(jīng)遞質(zhì)控制，這些神經(jīng)遞質(zhì)同時(shí)又受A2A受體的調(diào)節(jié)。A2A受體可以刺激紋狀體神經(jīng)元中乙酰膽堿的釋放。阻斷腺苷A2A受體，可使多巴胺D2受體活性增加，調(diào)節(jié)紋狀體內(nèi)γ-氨基丁酸能神經(jīng)元、抑制乙酰膽堿和興奮性氨基酸，起到治療PD的作用。腺苷A2A受體拮抗劑作為非多巴胺靶點(diǎn)已發(fā)展成為治療PD的熱點(diǎn)[9]。

實(shí)驗(yàn)中采用旋轉(zhuǎn)檢測(cè)儀記錄大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，采用免疫熒光法大鼠腦紋狀體及黑質(zhì)腺苷A2A受體表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用補(bǔ)腎活血顆粒干預(yù)后，治療組大鼠旋轉(zhuǎn)行為與治療前相比明顯改善，模型組大鼠無(wú)明顯變化，提示補(bǔ)腎活血顆?？梢愿纳芇D模型大鼠旋轉(zhuǎn)行為。腺苷A2A受體在帕金森大鼠腦紋狀體有廣泛表達(dá)，而在黑質(zhì)中無(wú)表達(dá)，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]。腺苷A2A受體在電鏡下染色呈紅色，正常大鼠腦紋狀體腺苷A2A受體表達(dá)較帕金森模型大鼠減弱，治療組與對(duì)照組比較表達(dá)又減弱，說(shuō)明應(yīng)用補(bǔ)腎活血顆粒干預(yù)后帕金森大鼠腦紋狀體中腺苷A2A受體表達(dá)減弱，課題組推測(cè)補(bǔ)腎活血顆粒治療帕金森病的作用機(jī)制可能與抑制腺苷A2A受體表達(dá)有關(guān)，抑制腺苷A2A受體表達(dá)、間接升高多巴胺D2受體的活性，起到了多巴胺受體保護(hù)的作用。

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(本文編輯：秦楠)

EffectofBushenHuoxueGranule(BSHXG)onadenosineA2AreceptorinbrainofParkinsonsdisease(PD)rats

GUOYun-xia,LIShao-dan,LIUYi,etal.

DepartmentofTraditionalChineseMedicine,PLAGeneralHospital,Beijing100853,China

Correspondingauther:YANGMing-hui,E-mail:ymh9651@yahoo.com.cn

ObjectiveTo explore the mechanism of treating Parkinson’s disease(PD)with Bushen Huoxue Granule(BSHXG).MethodsEstablishing rat model of PD with 6-hydroxydopamine lesion as medial forebrain bundle the right side of the brain of. 33 PD rats modes were randomly divided into treatment group 18 (BSHXG group) and control group 15. Additionally other 15 SD rats were selected in normal group. BSHXG was applied for treatment group once daily for 8 weeks. Physiologic saline was applied for control group and normal group in the same way. Gavage end, observed changes in the rotational behavior of PD rats. After decapitated, Immunofluorescence was used to observe the changes of adenosine A2A receptor in rat brain.ResultsRotational behavior of rats in the treatment group was much better improved than in the control group.A2A receptor expression in the treatment group compared with the control group was significantly decreased(P<0.01).A2A receptor expression in the model group was significantly increased than the normal group(P<0.01). A2A receptor were not expression in three groups of rats substantia nigra.ConclusionBSHXG can improve the rotational behavior of PD rats, inhibit adenosine A2A receptor expression in PD rat striatum, and has a significant therapeutic effect on the treatment of Parkinson’s disease.

Bushen Huoxue Granule(BSHXG); Parkinson’s disease rats; Adenosine A2A receptor

國(guó)家自然科學(xué)基金(81273969)

100853 北京，解放軍醫(yī)學(xué)院[郭云霞(博士研究生)]；解放軍總醫(yī)院中醫(yī)科(郭云霞、李紹旦、劉毅、楊明會(huì))

郭云霞(1976- )，女，2011級(jí)在讀博士研究生。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合老年病。E-mail: guoyx1999@sina.com

楊明會(huì)(1962- )，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)副會(huì)長(zhǎng)，中國(guó)人民解放軍中醫(yī)藥學(xué)會(huì)會(huì)長(zhǎng)。研究方向：老年病中醫(yī)研究。E-mail: ymh9651@yahoo.com.cn

R742.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2014.03.002

2014-01-15)