余柯達(dá)， 路 梅， 葉美娟， 凌丹燕

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

膠孢炭疽菌(ColletotrichumgloeosporioidesPenz)是引起植物炭疽病的病原真菌，可侵染花、果實、葉片和枝梢等植物各個器官，常引起落花、落葉、落果、枝梢枯死、樹皮爆裂、貯藏期果實腐爛等癥狀，造成樹勢衰弱及減產(chǎn)減收[1-2]．目前，對植物炭疽病的防治主要以化學(xué)防治為主，但是由于連續(xù)多年單一性殺菌劑的大量使用，導(dǎo)致該病菌在不少地區(qū)出現(xiàn)了較強(qiáng)的抗藥性，致使農(nóng)藥的效果大幅下降[3]．已有研究表明，芒果和油茶的炭疽病病原真菌已對苯并咪唑類殺菌劑多菌靈等產(chǎn)生了抗性[4-5]．對芳香樟炭疽病的防治研究也發(fā)現(xiàn)，多年使用的保護(hù)性殺菌劑波爾多液對病害的防治效果已經(jīng)很低[6]．殺菌劑主要分為3類：一類是具有高效內(nèi)吸作用的內(nèi)吸型殺菌劑，如苯并咪唑類殺菌劑多菌靈；另一類是具有保護(hù)治療作用的保護(hù)型殺菌劑，如二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲；第3類是具有復(fù)合防治作用的殺菌劑，如低毒的三唑類新一代強(qiáng)力殺菌劑苯甲丙環(huán)唑．有效中濃度或半數(shù)有效濃度(median effect concentration，EC50)是衡量殺菌劑毒力的重要指標(biāo)，其值大小的改變程度是產(chǎn)生抗藥性的標(biāo)志[7]．

浙江省金華市是國內(nèi)茶花和佛手的主要產(chǎn)區(qū)之一，炭疽病發(fā)生普遍，嚴(yán)重影響了植物的觀賞和經(jīng)濟(jì)價值．迄今為止，對于佛手和四季茶花炭疽病防治中病原菌對殺菌劑敏感性的研究尚未見報道．本研究采用菌絲生長速率法測定了3種類型6種殺菌劑對四季茶花和佛手炭疽病菌的室內(nèi)毒力，明確了病原菌對殺菌劑的敏感性現(xiàn)狀，為科學(xué)防治植物炭疽病害提供實驗依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 菌株

茶花和佛手膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)由本實驗室分離純化并保藏．

1.2 供試殺菌劑

1)保護(hù)型殺菌劑：2%波爾多液懸浮液SC(自配)；50%異菌脲懸浮劑FW(深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司)．

2)內(nèi)吸型殺菌劑：50%多菌靈可濕性粉劑WP(上海瀘聯(lián)生物藥業(yè)(夏邑)有限公司)；15%惡霉靈可濕性粉劑WP(陜西西大華特科技實業(yè)有限公司)．

3)復(fù)合型殺菌劑：80%多福鋅可濕性粉劑WP(河北冠龍農(nóng)化有限公司)；30%苯甲丙環(huán)唑乳油EC(青島潤生農(nóng)化有限公司)．

1.3 供試殺菌劑對病原菌的毒力測定

根據(jù)使用說明，將適量的殺菌劑溶入6 mL無菌水中，再加入到含54 mL馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的錐形瓶中(培養(yǎng)基溫度為60 ℃左右)，混合均勻后倒平板，以無菌水作空白對照．將保藏的炭疽病病原菌活化培養(yǎng)，25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，再在其菌落邊緣用滅菌的打孔器移取7 mm直徑的菌絲塊接種到帶藥平板培養(yǎng)基上，每處理設(shè)置3個重復(fù)，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照菌落直徑長至培養(yǎng)皿直徑的約2/3時，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌落直徑平均值和菌絲生長抑制率.菌絲生長抑制率計算公式為

將菌絲生長抑制率換算成概率值(y)、殺菌劑濃度(x)，應(yīng)用Excel軟件求出各殺菌劑的毒力，按濃度與概率值回歸法求得線性回歸方程y=a+bx，并以回歸方程計算各供試殺菌劑對茶花和佛手炭疽病病原菌的抑制中濃度(EC50)[8]．

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑濃度設(shè)置

實驗所用每種殺菌劑的濃度設(shè)置依據(jù)殺菌劑的使用說明進(jìn)行系列室內(nèi)毒力測定預(yù)試驗結(jié)果確定．以保護(hù)型殺菌劑50%異菌脲懸浮劑FW為例，圖1和圖2顯示了不同濃度的異菌脲對2株病原菌的抑制作用.由圖1和圖2可見，隨著異菌脲濃度的減少，病原菌的菌落直徑明顯增加.結(jié)合50%異菌脲懸

圖1 茶花炭疽病菌在不同濃度異菌脲作用下的生長狀況圖

殺菌劑有效成分的質(zhì)量濃度/(mg5L-1)2%波爾多液懸浮液SC66.6750.0040.0028.5710.00/50%異菌脲懸浮劑FW255.00127.5085.0031.8812.755.1050%多菌靈可濕性粉劑WP1 000.00333.33100.0050.0025.0016.7715%惡霉靈可濕性粉劑WP1 500.001 000.00500.00100.0020.002.0080%多福鋅可濕性粉劑WP16.001.600.600.060.006/30%苯甲丙環(huán)唑乳油EC20.002.000.200.02//

注：有效成分質(zhì)量濃度的設(shè)置按照每種殺菌劑的使用說明和預(yù)試驗結(jié)果確定．

浮劑防治炭疽菌等真菌病害的使用濃度(1 000～1 500倍液)，最終選擇的異菌脲使用濃度為255.00，127.50，85.00，31.88，12.75，5.10 mg/L．其他殺菌劑的抑菌實驗存在同樣的趨勢．通過預(yù)試驗最終確定的6種殺菌劑有效成分的質(zhì)量濃度見表1．

2.2 保護(hù)型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測定

保護(hù)型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測定結(jié)果見表2．由表2可見：2%波爾多液對茶花和佛手炭疽菌的EC50值差異較大，分別為105.848 2 mg/L和214.870 8 mg/L；50%異菌脲對2種病原菌的EC50則較為接近，分別為109.081 0 mg/L和105.525 7 mg/L．但是，2種殺菌劑對供試菌株的EC50均大于100 mg/L，說明2種來源炭疽菌對2%波爾多液和50%異菌脲的敏感性較低，已經(jīng)產(chǎn)生了一定的抗藥性．

表2 保護(hù)型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果

2.3 內(nèi)吸型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測定

內(nèi)吸型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測定結(jié)果由表3可見：2種殺菌劑對供試菌株的EC50值為2 163.898 1～4 260.781 5 mg/L，均大于1 000 mg/L．表示2種來源的供試菌株對內(nèi)吸型殺菌劑50%多菌靈和15%惡霉靈的敏感性非常低，已經(jīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抗藥性．

表3 內(nèi)吸型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果

2.4 復(fù)合型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測定

復(fù)合型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病原菌的毒力測定結(jié)果見表4．表4中，30%苯甲丙環(huán)唑和80%多福鋅對2株供試菌株的EC50值為2.287 8～10.408 0 mg/L，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于保護(hù)型殺菌劑和內(nèi)吸型殺菌劑．實驗數(shù)據(jù)說明茶花和佛手炭疽病原菌對2種殺菌劑的敏感性很高，進(jìn)而表明復(fù)合型殺菌劑適用于植物炭疽病的防治．

表4 復(fù)合型殺菌劑對茶花和佛手炭疽病菌室內(nèi)毒力測定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

殺菌劑室內(nèi)毒力測定中EC50越小、斜率越大,說明病原菌對殺菌劑的反應(yīng)靈敏度越高，即隨著殺菌劑濃度的增加，抑制率明顯增大[9]．對實驗結(jié)果進(jìn)行相關(guān)回歸分析得出每種殺菌劑的毒力回歸方程和斜率，回歸方程的斜率與病原菌對殺菌劑的敏感性成正比．供試6種殺菌劑對茶花和佛手炭疽病菌毒力回歸方程的斜率分別為：2%波爾多液0.545 6和0.229 8；50%異菌脲0.119 7和0.118 9；50%多菌靈0.021 6和0.013 1；15%惡霉靈0.013 4和0.011 9；30%苯甲丙環(huán)唑16.697和13.068；80%多福鋅5.465 8和4.426 6．綜合EC50和毒力回歸方程的斜率，可以得出以下結(jié)論：首先，2種來源的供試菌株對6種殺菌劑的敏感性大小順序依次為：30%苯甲丙環(huán)唑>80%多福鋅>2%波爾多液>50%異菌脲>50%多菌靈>15%惡霉靈；其次，2種來源的供試菌株對不同類型殺菌劑的敏感性差異較大，內(nèi)吸型殺菌劑的EC50值近乎是保護(hù)型殺菌劑的百倍、復(fù)合型殺菌劑的千倍．

多菌靈和甲基硫菌靈同屬于苯并咪唑類殺菌劑．國內(nèi)已有研究證明膠孢炭疽菌對苯并咪唑類殺菌劑的敏感性低．例如，陳聃等[10]采用區(qū)分劑量法對浙江省葡萄炭疽病的抗藥性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，供試菌株群體對甲基硫菌靈的抗藥性頻率為37.04%，且均為高水平抗藥性菌株(Ben HR)，即能在含殺菌劑 100 mg/L平板上生長的菌株．本研究結(jié)果也證明，膠孢炭疽菌已經(jīng)對多菌靈等咪唑類內(nèi)吸型殺菌劑產(chǎn)生抗性；而且多菌靈對茶花和佛手的膠孢炭疽菌的EC50竟分別高達(dá)2 163.898 1和3 595.633 6 mg/L，說明供試菌株的抗藥性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于陳聃等的實驗結(jié)果．

膠孢炭疽菌具有潛伏侵染特性[11]，其分生孢子侵染和再侵染是病害發(fā)生和傳播的主要途徑．因此，殺菌劑對分生孢子萌發(fā)抑制率的高低是病害控制的關(guān)鍵之一．2013年劉霞等[12]對核桃炭疽病原菌膠孢炭疽菌的室內(nèi)毒力研究發(fā)現(xiàn)，異菌脲等殺菌劑對分生孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制作用．本研究采用的菌絲生長速率法測定了不同殺菌劑對菌株的抑菌作用，關(guān)于所用殺菌劑對孢子萌發(fā)率的影響研究正在進(jìn)行當(dāng)中．

綜上所述，建議：停用多菌靈等病原菌已經(jīng)產(chǎn)生抗性的內(nèi)吸型殺菌劑；生產(chǎn)實際中可用30%苯甲丙環(huán)唑和80%多福鋅這2種復(fù)合型殺菌劑進(jìn)行炭疽病害的防治，少用或輪換使用保護(hù)型殺菌劑．由于田間自然環(huán)境中病原物、寄主和環(huán)境之間存在著復(fù)雜的關(guān)系，本研究所用殺菌劑在田間的抑菌效果尚需進(jìn)一步的實驗驗證．

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