魏玉君， 邵鄰相， 麻艷芳， 成文召， 高海濤， 張璐敏

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

佛手(Citrus medica L. var. sarcodactylis (Noot.) Swingle)是蕓香科(Rutaceae)柑桔屬的常綠小喬木，為香櫞(Citrus medica L.)的變種，主產(chǎn)于閩、粵、川、江、浙等省份，其中以浙江金華佛手(金佛手)最為著名，被稱為“果中之鮮品，世上之奇卉”.佛手是名貴的傳統(tǒng)中藥，其花、葉、果實(shí)均可入藥，具有行氣止痛、舒肝和胃、化痰止咳等功效，可用于治療胸悶氣滯、胃脘疼痛、嘔吐、食欲不振、痰飲咳喘和氣管炎等病癥[1].研究表明：佛手柑揮發(fā)油的主要成分為香豆素類化合物、檸檬烯、蒈烯等[2-6]，具有抑菌作用[7-8]，對體外培養(yǎng)的人乳腺癌細(xì)胞[9]、B16黑色素瘤細(xì)胞[10]及體內(nèi)B16黑色素移植瘤均有抑制作用[11]；佛手揮發(fā)油還可降低哮喘小鼠外周血、支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞的水平，減少肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，拮抗氣道炎癥而發(fā)揮平喘作用[12].佛手葉不僅是重要的光合作用器官，也是重要的營養(yǎng)器官和儲(chǔ)藏器官，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)利用價(jià)值[13].然而，佛手葉揮發(fā)油的主要成分和含量是否與佛手柑相同，是否也具有類似的抗菌抑癌作用，目前還未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)用水蒸氣蒸餾法提取了金華佛手葉揮發(fā)油，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)法分析了其成分，并分別用比濁法和噻唑藍(lán)(MTT)法測定了佛手葉揮發(fā)油的抗菌抑癌作用，以期為佛手葉揮發(fā)油的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

草綠色鏈球菌等6株細(xì)菌由浙江省金華市中心醫(yī)院提供；Hep3B等6株癌細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所；新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶：Gibco公司；吐溫-80、噻唑藍(lán)(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)：Sigma公司.

QP5050A型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和1500型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀：美國熱電公司.

1.2 揮發(fā)油的提取

參考文獻(xiàn)[9]，采用水蒸氣蒸餾法提取金華佛手葉揮發(fā)油，無水硫酸鈉干燥，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.3 揮發(fā)油的氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

色譜柱：VF-Wax石英毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；初始溫度60 ℃保持2 min，升溫至250 ℃保持10 min，升溫速度為15 ℃/min；汽化溫度為230 ℃；載氣He，流量為1.0 mL/min；分流比為200∶1；進(jìn)樣量為1.0 μL.

質(zhì)譜檢測器：EI電離源、電離電壓70 eV，離子源溫度為200 ℃，進(jìn)樣量為1.0 μL.

1.4 比濁法測定抑菌活性

細(xì)菌以2×103個(gè)/孔接種于96孔板中，加入100 μL揮發(fā)油溶液，使其終濃度分別為0，10，15和30 g/L，37 ℃培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀600 nm波長下測定吸光度值，參考文獻(xiàn)[14]的方法計(jì)算抑菌率，作圖得出IC50值.

1.5 MTT法檢測細(xì)胞活力

佛手葉揮發(fā)油作用于細(xì)胞6，12和24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL噻唑藍(lán)溶液，每組5個(gè)重復(fù)，37 ℃孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜，避光振蕩15 min，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm波長下測定吸光度(A)值，計(jì)算各組細(xì)胞存活率.

1.6 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與討論

2.1 佛手葉揮發(fā)油成分分析

對佛手葉揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，得到的佛手葉揮發(fā)油總離子流圖如圖1所示.

圖1 佛手葉揮發(fā)油的總離子流圖

由表1可知，本實(shí)驗(yàn)從佛手葉揮發(fā)油中鑒定出40種成分，其中主要成分為d-檸檬烯、γ-松油烯、對-傘花烴、α-蒎烯、β-蒎烯、檸檬醛、β-檸檬醛、d-異松油烯、β-反式-羅勒烯和2-甲基-5-(1-甲乙基)-二環(huán)[3.1.0]己-2-烯等化合物，此外還有部分酯類和酮類化合物.佛手葉揮發(fā)油中d-檸檬烯和γ-松油烯的含量最高，這與文獻(xiàn)[3,15]中佛手柑揮發(fā)油的主要成分一致.然而，金曉玲等[16]采用水蒸氣蒸餾法提取的佛手柑揮發(fā)油的主要成分是檸檬烯(48.4%)和鄰-傘花烴(30.8%)；周露等[17]從佛手葉揮發(fā)油中鑒定出30種成分，主要成分為檸檬烯、香葉醛、橙花醛、6-甲基-5-庚烯-2-酮和β-月桂烯等.佛手葉的有效成分含量不僅受植株自身養(yǎng)分積累和葉內(nèi)碳水化合物積累的影響，還受光照、溫度、水分和土壤等環(huán)境條件的影響[13]，產(chǎn)地、氣候、栽培條件等因素的不同可能是佛手葉揮發(fā)油主要成分產(chǎn)生差異的主要原因.

表1 佛手葉揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表1

2.2 佛手葉揮發(fā)油對細(xì)菌增殖的抑制作用

如表2所示:草綠色鏈球菌對佛手葉揮發(fā)油最敏感，其IC50為1.1 mg/mL;肺炎克雷伯菌次之，其IC50為2.1 mg/mL；表皮葡萄球菌對佛手葉揮發(fā)油相對不敏感，其IC50為13.7 mg/mL;而溶血性鏈球菌對佛手葉揮發(fā)油最不敏感，其IC50為19.3 mg/mL.表明佛手葉揮發(fā)油具有抑制細(xì)菌增殖的作用.郭衛(wèi)東等[7]采用濾紙片法測定佛手揮發(fā)油的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)佛手柑揮發(fā)油對酵母菌、大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑制作用，而佛手葉揮發(fā)油僅對酵母菌有一定的抑制作用.這可能是因?yàn)椴煌募?xì)菌種別對佛手葉揮發(fā)油的敏感性不同所致.佛手葉和佛手柑揮發(fā)油中2種含量較高的成分都是d-檸檬烯和γ-松油烯[3,15]，但其他主要成分及其含量存在著差異性[17]；另外，不同的測定方法也存在著差異性.用濾紙片法測定揮發(fā)油的抑菌作用，可能因?yàn)榉鹗秩~揮發(fā)油的揮發(fā)作用而導(dǎo)致其有效成分減少；但比濁法則不會(huì)出現(xiàn)這種情況.以上說明，佛手葉揮發(fā)油對細(xì)菌有明顯的抑制作用，將其用在食品、藥品、化妝品等方面具有廣闊的前景.

表2 佛手葉揮發(fā)油對細(xì)菌活力的影響

2.3 佛手葉揮發(fā)油對癌細(xì)胞增殖的抑制作用

如表3所示，佛手葉揮發(fā)油對6種癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，隨著時(shí)間的增加，IC50值越小，抑制作用越強(qiáng)，呈良好的時(shí)效關(guān)系.其中：Hep3B肝癌細(xì)胞對佛手葉揮發(fā)油最為敏感，佛手葉揮發(fā)油作用于Hep3B肝癌細(xì)胞6，12和24 h的IC50分別為102.9，94.6和79.3 mg/mL；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HUVEC次之；PANC-28胰腺癌細(xì)胞對佛手葉揮發(fā)油相對最不敏感，揮發(fā)油作用于PANC-28細(xì)胞6，12和24 h的IC50分別為347.9，329.5和279.9 mg/mL.本課題組已報(bào)道的研究表明，佛手柑揮發(fā)油對體外培養(yǎng)的B16黑色素瘤細(xì)胞、MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞有顯著的抑制作用，低劑量的佛手柑揮發(fā)油可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，而高劑量的佛手柑揮發(fā)油可直接導(dǎo)致癌細(xì)胞壞死[9-10]；佛手柑揮發(fā)油對體內(nèi)小鼠B16黑色素移植瘤也有顯著的抑制作用，這與其增強(qiáng)了小鼠的抗氧化能力有關(guān)[11]. 佛手葉揮發(fā)油與佛手柑揮發(fā)油均具有含量最高的d-檸檬烯和γ-松油烯[3,15]，以及多種其他相同成分[17]，佛手葉揮發(fā)油也可能通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡來抑制其增殖.具體哪種成分起抗癌抑瘤作用，還有待于更深入的研究.

表3 佛手葉揮發(fā)油對癌細(xì)胞活力的影響

3 結(jié) 論

從佛手葉揮發(fā)油中鑒定出40種成分，其主要成分為d-檸檬烯、γ-松油烯、對傘花烴、α-蒎烯、β-蒎烯等，d-檸檬烯和γ-松油烯的含量最高，分別為50.53%和24.05%.佛手葉揮發(fā)油對草綠色鏈球菌等6種細(xì)菌、Hep3B等6種癌細(xì)胞均有明顯的抑制作用，而發(fā)揮作用的具體成分還有待于更進(jìn)一步的研究.采用水蒸氣蒸餾法提取佛手葉揮發(fā)油，得率高、產(chǎn)量穩(wěn)定、無有機(jī)溶劑殘留、無污染，將其直接應(yīng)用在食品、藥品和化妝品等方面具有廣闊的前景[18].本實(shí)驗(yàn)為佛手的綜合利用和深加工提供了科學(xué)依據(jù).

[1]王浴生,鄧文龍,薛春生.中藥藥理與應(yīng)用[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:557-559.

[2]張穎,孔令義.佛手化學(xué)成分的研究[J].中國現(xiàn)代中藥,2006,8(6):16-17.

[3]楊榮華.佛手柑精油化學(xué)成分的分析[J].分析化學(xué),2002,30(9):1149.

[4]尹鋒,成亮,樓鳳昌.佛手化學(xué)成分的研究[J].中國天然藥物,2004,2(3):149-151.

[5]Menichini F,Tundis R,Bonesi M,et al.Chemical composition and bioactivity ofCitrusmedicaL. cv. Diamante essential oil obtained by hydrodistillation,cold-pressing and supercritical carbon dioxide extraction[J].Nat Prod Res,2011,25(8):789-799.

[6]Marie-Laure L,Dominique de R S,Felix T,et al.Chemical composition of peel and leaf essential oils ofCitrusmedicaL.andC.limonimedicaLush[J].Flavour and Fragrance Journal,1999,14(3):161-166.

[7]郭衛(wèi)東,鄭建樹,鄧剛,等.佛手揮發(fā)油抑菌活性的研究[J].中國糧油學(xué)報(bào),2009,24(8):103-107.

[8]Essien E P,Essien J P,Ita B N,et al.Physicochemical properties and fungitoxicity of the essential oil ofCitrusmedicaL. against groundnut storage fungi[J].Turk J Bot,2008,32:161-164.

[9]麻艷芳,邵鄰相,張均平,等.佛手揮發(fā)油對MDA-MB-435人乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響[J].中國藥學(xué)雜志,2010,45(22):1737-1741.

[10]呂學(xué)維,邵鄰相,張均平,等.佛手揮發(fā)油對B16黑色素瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用[J].中國糧油學(xué)報(bào),2011,26(8):50-54.

[11]邵鄰相,高海濤,成文召,等.佛手揮發(fā)油對小鼠體內(nèi)B16黑色素瘤生長的影響[J].浙江師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2012,35(2):184-188.

[12]施長春,王建英,朱婉萍,等.佛手揮發(fā)油對支氣管哮喘小鼠外周血、肺泡灌洗液及肺組織中嗜酸性粒細(xì)胞的影響[J].中草藥,2009,40(1):99-101.

[13]陳鵬,王莉,顧躍君,等.佛手葉用性狀的分析研究[J].揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào):農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版,2004,25(3):74-78.

[14]李美,邵鄰相,徐玲玲,等.野胡蘿卜花揮發(fā)油成分分析及生物活性研究[J].中國糧油學(xué)報(bào),2012,27(9):112-115.

[15]趙磊,籍保平,周峰,等.十二種金華佛手揮發(fā)油成分的比較研究[J].食品科學(xué),2006,27(6):179-184.

[16]金曉玲,徐麗珊，鄭孝華.佛手揮發(fā)油的化學(xué)成分[J].分析測試學(xué)報(bào),2000,19(4):71-73.

[17]周露,陳劍昌,任洪濤,等.佛手油化學(xué)成分研究[J].香料香精化妝品,2000(2):7-10.

[18]趙興杰,籍保平,趙磊,等.佛手揮發(fā)油不同提取方法的比較研究[J].食品科學(xué),2007,28(4):167-170.