劉 璐，閆 浩，李 誠，李 源，周 楊，張庭廷

(安徽師范大學生命科學學院;生物環(huán)境與生態(tài)安全安徽省高校重點實驗室，蕪湖241000)

近年來，我國重特大重金屬污染事件時有發(fā)生，其中，以鉛污染尤為突出。由于進入水體中的重金屬會隨著食物鏈傳遞而在生物體內(nèi)積累，破壞生物的正常代謝與功能，最終對水生態(tài)系統(tǒng)以及人類健康造成危害［1-2］。在水體重金屬污染的防控研究中，浮游藻類因其某些獨特的優(yōu)勢而備受關(guān)注。一方面藻類是水生生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者，外來重金屬的侵入必然會使生長在水體中的各種藻類首先受到不同程度的毒害，在對高等水生植物無可見傷害的低劑量污染情況下，藻類就可能出現(xiàn)形態(tài)和生理指標的變化［3］。因此，利用一些對重金屬敏感的藻類作為指示生物，可以監(jiān)測水體重金屬污染的程度［4-9］。另一方面，浮游藻類生長速度快，不少藻類對重金屬具有較強富集作用，因此浮游藻類被認為是一類處理水體中重金屬污染的優(yōu)良生物材料［10］，篩選適宜藻類去除水體中的重金屬，被認為是一項高效、低耗、經(jīng)濟、環(huán)保、具有廣闊應(yīng)用前景的新型技術(shù)［11］。到目前為止，關(guān)于浮游藻類對重金屬的吸附、吸收作用已有一些研究，但是重金屬鉛與水體最常見水華藍藻銅綠微囊藻和常見綠藻斜生柵藻之間的相互作用卻幾乎未見報道。因此，本研究深入探討了鉛與銅綠微囊藻、斜生柵藻之間的相互作用，以便為鉛污染的預(yù)警以及生物治理提供重要的理論與實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗藻種銅綠微囊藻(M.aeruginosa Kutz.)和斜生柵藻(S.obliquus(Turp.)Kutz.)均購自中科院武漢水生生物研究所，分別采用BG-11［12］和HB-4［13］培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 藻的培養(yǎng)

實驗前一周，兩種藻分別用培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng)。無菌條件下，在已洗凈滅菌的1000 mL三角錐形瓶中加入100 mL BG-11培養(yǎng)基，接入銅綠微囊藻藻種，搖勻，置光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:光照度4000 lx，光周期12L∶12D，溫度(24±2)℃，pH值7.0。每天搖動錐形瓶4次，每24 h添加100 mL新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至藻細胞進入對數(shù)生長期。斜生柵藻的培養(yǎng)基用HB-4培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)條件同銅綠微囊藻。

無菌條件下，取上述藻液分別加入到500 mL已滅菌三角燒瓶，加入新鮮無菌BG-11或HB-4培養(yǎng)基，然后加入Pb(NO3)2，銅綠微囊藻的起始密度為7.5×105個/mL，斜生柵藻的起始密度為3×105個/mL，Pb2+終濃度為3，6，9，12 mg/L，每組3個平行，對照組不加Pb(NO3)2，培養(yǎng)條件同藻種擴大培養(yǎng)。

1.2.2 相關(guān)試驗指標的測定

主要測定的指標有:藻細胞的形態(tài)變化，藻細胞計數(shù)，測定反映膜通透性的電導率的變化，測定超氧化物陰離子自由基含量、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性以及藻細胞內(nèi)Pb2+含量，除酶活力和Pb2+含量最后一天測定，其余各指標每隔24 h測定1次。

1.2.3 藻對鉛的吸收處理方法

取藻液50 mL，用15 μg/mL的NaHCO3和蒸餾水各洗3次，然后烘干、稱重及消化處理，用J-8000原子吸收分光光度計測定鉛含量。

藻細胞形態(tài)的觀察采用掃描電鏡。取藻細胞，2500 rpm離心收獲，采用無菌培養(yǎng)基洗2—3次，置于2.5%戊二醛中固定2 h，再用新鮮配制的0.1 mol/L PBS緩沖液沖洗3次，最后用系列乙醇(脫水劑的乙醇濃度依次為30%—50%—70%—80%—90%—100%乙醇(兩次)脫水，醋酸異戊酯置換后，CO2臨界點干燥，金屬噴鍍，掃描電鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)的處理采用SPSS13.0軟件，圖用Excel軟件制作。對照組和處理組之間采用單因素方差分析，P＜0.05表示有顯著性差異;P＜0.01表示有極顯著性差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 鉛對兩種藻生物量的影響

圖1和圖2是不同濃度Pb2+對兩種藻生長動態(tài)的影響。圖1顯示，Pb2+對銅綠微囊藻的抑制強度與Pb2+濃度呈正相關(guān)。從第4天開始，濃度為3，6 mg/L處理組的藻細胞數(shù)均比同期對照組高;在第6天時，3 mg/L處理組與對照組差異達到極顯著(P＜0.01)，說明低濃度(3 mg/L)Pb2+對銅綠微囊藻的生長有促進作用;然而9，12 mg./L處理組藻細胞數(shù)目始終低于同期對照組，在第6天時，兩處理組與對照組相比差異極顯著(P＜0.01)，說明高濃度(9，12 mg/L)Pb2+對銅綠微囊藻的生長有抑制作用。該結(jié)果表明在3—12 mg/L范圍內(nèi)，Pb2+對銅綠微囊藻的生長起著低促高抑的效果。

圖2顯示，不同濃度(3—12 mg/L)的Pb2+對斜生柵藻均有非常明顯地抑制作用。從第1天開始，各處理組的藻細胞數(shù)目就明顯低于同期對照組(P＜0.01)，說明Pb2+對斜生柵藻有較強的抑制作用。同時還表明，在Pb2+濃度為3—12 mg/L范圍內(nèi)，其對斜生柵藻的抑制作用要明顯大于對銅綠微囊藻，說明了斜生柵藻對Pb2+的毒性敏感程度較銅綠微囊藻強烈。

圖2 Pb2+對斜生柵藻生長的影響Fig.2 The effects of Pb2+on the growth of S.obliquus

2.2 鉛對兩種藻膜通透性的影響

如表1所示，隨著Pb2+濃度的升高以及作用時間的延長，銅綠微囊藻藻液電導率的變化沒有呈現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律，雖然在第2天，銅綠微囊藻3—9 mg/L處理組藻液電導率隨Pb2+濃度的升高而逐漸上升，與同期對照組相比6，9 mg/L處理組差異顯著(P＜0.05)，但在第6天，除最高濃度組(12 mg/L)與同期對照組相比差異顯著(P＜0.05)外，其余各組卻差異不顯著。提示在Pb2+脅迫下，銅綠微囊藻細胞膜的通透性可有部分改變，但Pb2+對銅綠微囊藻的抑制作用可能還有更為復雜的作用機制。

表2顯示，在第2、4天時，各處理組與同期對照組相比差異顯著，均高于對照組，表明由于環(huán)境脅迫，斜生柵藻細胞膜首先受到影響，使一些小分子物質(zhì)外滲，造成藻液電導率上升;但與Pb2+作用于銅綠微囊藻的結(jié)果相似，到第6天時，斜生柵藻各處理組電導率與同期對照組相比差異也無顯著性，不能簡單通過細胞膜通透性改變來解釋Pb2+對此兩種藻類的抑制作用機制。

表1 Pb2+對銅綠微囊藻藻液電導率的影響/×103Table1 Effect of Pb2+on conductivity of M.aeruginosa/×103

表2 Pb2+對斜生柵藻藻液電導率的影響/×103Table2 Effect of Pb2+on conductivity of S.obliquus/×103

表3 Pb2+對銅綠微囊藻含量的影響Table3 Effect of Pb2+oncontents of M.aeruginosa

表3 Pb2+對銅綠微囊藻含量的影響Table3 Effect of Pb2+oncontents of M.aeruginosa

表中數(shù)據(jù)為平均值±SE(n=3);*與同期對照組比較，P＜0.05;＊＊與同期對照組比較，P＜0.01

Pb2+濃度Pb2+contens/(mg/L)銅綠微囊藻O-·2含量O-·2contents of M.aeruginosa/(μmol/L)第0天第2天第4天第6天CK0.85±0.000.45±0.200.55±0.090.80±0.05 3 0.85±0.000.75±0.05＊＊0.65±0.20*0.90±0.05 6 0.85±0.000.80±0.00＊＊0.70±0.03*1.00±0.24*9 0.85±0.000.65±0.08＊＊0.75±0.09＊＊1.15±0.15＊＊120.85±0.000.70±0.14*0.80±0.50＊＊1.15±0.60＊＊

表4 Pb2+對斜生柵藻含量的影響Table4 Effect of Pb2+on contents of S.obliquus

表4 Pb2+對斜生柵藻含量的影響Table4 Effect of Pb2+on contents of S.obliquus

表中數(shù)據(jù)為平均值±SE(n=3);*與同期對照組比較，P＜0.05;＊＊與同期對照組比較，P＜0.01

Pb2+濃度Pb2+contens/(mg/L)斜生柵藻O-·2含量O-·2contents of S.obliquus/(μmol/L)第0天第2天第4天第6天CK0.20±0.000.20±0.220.20±0.060.25±0.10 3 0.20±0.000.30±0.03＊＊0.25±0.03*0.45±0.10＊＊6 0.20±0.000.30±0.35＊＊0.30±0.10＊＊0.45±0.17＊＊9 0.20±0.000.35±0.03＊＊0.45±0.26＊＊0.50±0.29＊＊120.20±0.000.55±0.08＊＊0.50±0.28＊＊0.55±0.29＊＊

2.4 鉛對兩種藻POD、CAT活性的影響

由圖3可知，隨著Pb2+濃度的增加，銅綠微囊藻和斜生柵藻藻細胞內(nèi)的POD活性均呈先上升后下降的趨勢，活性達到最大時，分別是對照組的166.16%(銅綠微囊藻實驗組)和209.17%(斜生柵藻實驗組)，之后逐漸降低，但即便是當POD的活性達到最低時，也分別是對照組的133.04%和124.40%。

由圖3所示，銅綠微囊藻和斜生柵藻藻細胞內(nèi)的CAT活性隨Pb2+濃度的上升而增加，活性達到最大時，分別是對照組的255.40%和222.01%，與同期對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

圖3 不同濃度的Pb2+處理對銅綠微囊藻和斜生柵藻POD和CAT活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of Pb2+exposure on POD and CAT activities of M.aeruginosa and S.obliquus

2.5 兩種藻對鉛的吸收作用

如圖4所示，隨著藻液中Pb2+濃度的上升，銅綠微囊藻和斜生柵藻藻細胞中Pb2+含量均呈先上升后下降的趨勢，在Pb2+濃度為9 mg/L時達最高，藻細胞內(nèi)最高Pb2+含量分別為:22.73 mg/g、36.59 mg/g，表明在3—9 mg/L時，兩種藻對Pb2+的吸收能力隨Pb2+濃度的上升而增強，在9 mg/L以上濃度時兩種藻吸收Pb2+的吸收能力開始下降，這可能由于高濃度時，Pb2+對兩種藻的生長有較強抑制性，藻細胞功能受阻，以致對Pb2+的吸收能力開始下降。但單位量藻細胞內(nèi)，斜生柵藻對Pb2+的吸收能力明顯好于銅綠微囊藻

圖4 不同Pb2+濃度下銅綠微囊藻和斜生柵藻細胞內(nèi)Pb2+含量Fig.4 The intra-celluar Pb2+content of M.aeruginosa and S.obliquus under different concentrations of Pb2+treatment after 6 days

2.6 不同鉛濃度下兩種藻的表面結(jié)構(gòu)

圖5左側(cè)圖顯示的是不同濃度下銅綠微囊藻藻細胞的表面結(jié)構(gòu)，在不含Pb2+的條件下，藻細胞個體分明，細胞表面光滑;在低濃度(3—6 mg/L)時，藻細胞仍是個體分明，但細胞表面開始有絮狀物，且絮狀物隨Pb2+濃度的上升而增加;在高濃度(9—12 mg/L)時，藻細胞表面和周圍分布著大量的絮狀物，細胞個體不分明，常見多個細胞及其細胞碎片粘合在一起。

圖5右側(cè)圖顯示的是不同濃度下斜生柵藻藻細胞的表面結(jié)構(gòu)。同樣，在不含Pb2+的條件下，藻細胞個體分明，細胞表面光滑;在濃度為3 mg/L的處理組中，藻細胞個體仍然分明，但細胞表面開始有絮狀物;隨著Pb2+濃度的上升，藻細胞表面和周圍絮狀物明顯增多，細胞個體不分明，細胞形態(tài)改變，出現(xiàn)破裂現(xiàn)象，常見多個細胞及其細胞碎片粘合在一起。

由兩組圖比較可以看出，斜生柵藻對Pb2+較敏感，Pb2+對斜生柵藻的作用要強于對銅綠微囊藻，這與前面Pb2+對兩組藻細胞生長趨勢的影響一致。

3 結(jié)論與討論

圖5 不同Pb2+濃度下銅綠微囊藻和斜生柵藻細胞的表面結(jié)構(gòu)Fig.5 Superficial structure of M.aeruginosa and S.obliquus under different concentrations Pb2+treatment after 6 days

3.1 Pb2+對斜生柵藻和銅綠微囊藻均具有明顯的毒性作用，但對銅綠微囊藻的毒性要小于對斜生柵藻，且對銅綠微囊藻的生長具有雙重影響，低濃度Pb2+能促進生長，這一結(jié)論與何學佳的研究結(jié)果一致［17］，而高濃度的Pb2+才抑制其生長，即低促高抑。這可能的原因較為復雜，一方面可能與該兩藻細胞的表面結(jié)構(gòu)不同有關(guān);另外，是否銅綠微囊藻能通過釋放微囊藻毒素對胞外的重金屬離子進行絡(luò)合，從而妨礙了重金屬離子的跨膜轉(zhuǎn)運，使銅綠微囊藻對重金屬表現(xiàn)出一定的耐受性呢?有關(guān)藻毒素對重金屬離子的生物有效性本課題組正在進行深入研究。從本研究Pb2+對兩藻的毒性機制還可看出，高濃度的Pb2+不僅破壞了細胞膜的通透性，大量無機鹽和有機物質(zhì)外滲，而且通過兩藻的細胞表面結(jié)構(gòu)圖可以看出兩種藻細胞表面有大量絮狀物，甚至出現(xiàn)粘連現(xiàn)象，這可能是由于細胞破裂后細胞碎片等與細胞粘結(jié)在一起所致。再者，Pb2+迫使細胞內(nèi)含量增加，細胞膜脂質(zhì)過氧化增強，當細胞內(nèi)氧自由基濃度超過一定范圍時，細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)不能將其及時清除，從而出現(xiàn)抗氧化酶活性開始升高以后降低的現(xiàn)象，抗氧化酶含量減少，又進一步加大了Pb2+對兩種藻的毒害。

3.2 銅綠微囊藻和斜生柵藻對鉛均有良好吸收作用。國內(nèi)外大量研究都表明藻類對重金屬具有較強的富集能力［18-21］。如孔石莼對Pb2+的單層飽和結(jié)合量為0.715 mg/g［20］，海帶對Pb2+的吸附量為1.33 mmol/g［21］。然而像這些用海藻處理重金屬的研究比較廣泛，對于用淡水藻來處理重金屬的研究卻相對較少。本試驗結(jié)果顯示常見淡水藻銅綠微囊藻和斜生柵藻對Pb2+均有良好吸收作用。在一定范圍(3—9 mg/L)內(nèi)，兩種藻對Pb2+的吸收能力隨Pb2+濃度的上升而增強，在9 mg/L以上濃度時兩種藻吸收Pb2+的吸收能力才開始下降;單位量藻細胞內(nèi)，斜生柵藻對Pb2+的吸收能力要高于銅綠微囊藻。

綜合以上結(jié)果，由于斜生柵藻對Pb2+更為敏感，因此，可以考慮如何能利用斜生柵藻來作為對重金屬鉛的敏感指示生物來監(jiān)測水體Pb2+污染程度;同時，相比一些大型海藻如石莼，斜生柵藻對Pb2+具有較好的吸收作用，最高單位吸收量可達36.59 mg/g，而且斜生柵藻是不產(chǎn)生毒素的綠藻類，對環(huán)境污染較小，因此斜生柵藻具有開發(fā)成為處理水體鉛污染良好生物材料的潛能。

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