崔宗巖， 孫 揚(yáng)， 葛 娜， 張進(jìn)杰， 劉永明， 李阿丹， 曹彥忠*

(1.秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，河北秦皇島066004;2.燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，河北秦皇島066004)

有機(jī)錫類農(nóng)藥主要包括三環(huán)錫、三唑錫、苯丁錫、薯瘟錫(三苯基乙酸錫)和毒菌錫(三苯基氫氧化錫)等，常作為殺螨劑和殺菌劑廣泛用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［1］。這5種化合物均具有較強(qiáng)的生物毒性，而且在環(huán)境中有良好的穩(wěn)定性，殘留期較長，存在對人體的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)［2］。我國于1987年禁用三環(huán)錫。三唑錫主要官能團(tuán)與三環(huán)錫相同，二者施用后在農(nóng)產(chǎn)品中殘留物均為三環(huán)錫。薯瘟錫和毒菌錫主要官能團(tuán)也相同，殘留物均為三苯錫。

我國新近實(shí)施的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2763-2012規(guī)定了蘋果、梨、柑橘、番茄、土豆等水果和蔬菜中三唑錫、三苯錫和苯丁錫的殘留限量，限量范圍為0.1～2.0 mg/kg。國外對蔬菜和水果中有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留有更嚴(yán)格的要求，如日本肯定列表規(guī)定部分水果蔬菜中三苯錫和苯丁錫的殘留限量分別達(dá)到0.02 mg/kg和0.05 mg/kg。因而，研究建立食品中有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留的檢測方法，對于規(guī)范進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行為，應(yīng)對國外貿(mào)易技術(shù)壁壘，維護(hù)國家經(jīng)濟(jì)利益和保護(hù)國民健康具有重要的意義。

圖1 三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的乙基化衍生反應(yīng)Fig.1 Ethylation of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide by EtMgBr

目前國內(nèi)外有機(jī)錫類農(nóng)藥殘留的儀器檢測方法包括氣相色譜-火焰光度檢測法［3，4］、氣相色譜-原子發(fā)射光譜法［2，5，6］、氣相色譜-電子俘獲檢測法［7，8］、氣相色譜-質(zhì)譜法［9-12］、液相色譜-質(zhì)譜法［13］、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法［14］和紅外光譜法［15］等。有機(jī)錫化合物的樣品前處理方法包括液固萃?。?，4，10］、固相萃?。?3］和固相微萃?。?，14，16］等。然而，現(xiàn)有很多方法僅能檢測單一或兩種有機(jī)錫農(nóng)藥，國內(nèi)外尚未見蔬菜或水果中三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫這3種有機(jī)錫農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測的報(bào)道。

本文研究建立了格氏試劑衍生結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法，可以實(shí)現(xiàn)水果和蔬菜中三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的同時(shí)檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法原理

三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫中的錫元素均為Ⅳ價(jià)，連接若干有機(jī)和無機(jī)基團(tuán)，由于其具有一定的極性或較高的相對分子質(zhì)量，難以直接氣化進(jìn)行氣相色譜分析，通常需要將Ⅳ價(jià)錫衍生為全有機(jī)基團(tuán)取代的形式。本實(shí)驗(yàn)采用格氏試劑乙基溴化鎂(EtMgBr)作為衍生試劑，衍生反應(yīng)如圖1所示。三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的衍生產(chǎn)物分別為三環(huán)己基乙基錫、三苯基乙基錫和三(2-甲基-2-苯基丙基)乙基錫。

1.2 儀器和裝置

Quattro micro型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(美國Waters公司)，配置 Agilent 7890氣相色譜儀;SA300型振蕩器(日本Yamato公司);EL131型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Büchi公司)，配有BP-51型真空冷卻系統(tǒng)(日本Yamato公司);KDC-40型低速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司);8893型超聲儀(美國Colc-Parmer公司);12通道固相萃取裝置(美國Phenomenex公司);N-EVAPTM112型氮吹儀(美國Organomation公司)。Milli-Q高純水發(fā)生器(美國Millipore公司)。

1.3 試劑和材料

三環(huán)錫(cyhexatin，純度97%)，三唑錫(azocyclotin，純度98%)和苯丁錫(fenbutatin oxide，純度99.5%)購自德國Dr.Ehrenstorfer公司。三苯基乙酸錫(fentin acetate，純度99.6%)和三苯基氫氧化錫(triphenyltin hydroxide，純度99%)購自美國Sigma Aldrich公司。有機(jī)錫標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.2 g/L(以Sn計(jì))，配制于丙酮溶液中，儲存在-20℃冰箱中。工作液質(zhì)量濃度1 mg/L(以Sn計(jì))，用超純水對儲備液進(jìn)行稀釋獲得。衍生試劑EtMgBr乙醚溶液(3 mol/L)購自日本TCI公司。弗羅里硅土固相萃取柱(Florisil，1 g/6 mL)購自美國Dikma公司。

所用其他試劑均為分析純及以上純度。所有玻璃容器在洗滌后用去離子水沖洗，用50%(v/v)硝酸溶液浸泡過夜，再用超純水清洗后烘干備用。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

稱取2 g(精確到0.01 g)勻漿后的蔬菜或水果試樣于80 mL離心管中，加入10 mL鹽酸/四氫呋喃溶液(1∶10，v/v)，劇烈振蕩2 min，放置 1 h。再加入20 mL正己烷，振蕩提取 45 min，在 3 000 r/min下離心3 min，取上清液于150 mL濃縮瓶中。殘?jiān)性俅渭尤胝和?0 mL，振蕩提取15 min，合并提取液，于35℃水浴中減壓濃縮至近干。向其中加入約1 mL正己烷溶解殘?jiān)?，待衍生?/p>

1.4.2 衍生

向上述提取液中加入3 mol/L EtMgBr乙醚溶液1 mL，密閉瓶塞，手動(dòng)振搖后超聲反應(yīng)15 min，然后在冷水浴條件下向其中逐滴加入5 mL 0.5 mol/L稀硫酸溶液，邊滴加邊手動(dòng)振搖。將溶解液完全轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，在3 000 r/min下離心5 min。此過程中需要注意的是，格氏試劑遇水劇烈反應(yīng)，容易引起危險(xiǎn)和導(dǎo)致目標(biāo)物的損失，衍生過程中必須嚴(yán)格控制，保持無水的環(huán)境，稀硫酸必須在冷水浴和手動(dòng)振搖的條件下逐滴加入。

1.4.3 凈化

將Florisil固相萃取小柱(柱內(nèi)填約1 cm的無水硫酸鈉)安裝在固相萃取的真空抽濾裝置上，先用6 mL正己烷預(yù)淋洗小柱。將上述衍生的上層有機(jī)相全部轉(zhuǎn)移至Florisil柱上，分兩次分別用1 mL正己烷清洗衍生液，并待Florisil柱中溶液的液面降至無水硫酸鈉層時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至柱上。再用10 mL正己烷/丙酮(99∶1，v/v)溶液進(jìn)行洗脫，控制流速≤3 mL/min，收集全部流出液，35℃下氮?dú)獯蹈?，用正己烷溶解并定容? mL，供GC-MS/MS測定。

1.5 GC-MS/MS 條件

氣相色譜條件:DB-1701色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度290℃，不分流進(jìn)樣;載氣為高純氦(純度≥99.999%)，恒定流速為1.5 mL/min;升溫程序:初始溫度50℃，保持1 min，以30℃/min升至290℃，保持10 min。

串聯(lián)質(zhì)譜條件:電子轟擊離子(EI)源，溫度230℃，傳輸線溫度為280℃，采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，每個(gè)化合物監(jiān)測兩對母離子-子離子。

本實(shí)驗(yàn)采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量。選取與待測樣品同類型的空白樣品基質(zhì)，向其中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻后依據(jù)上述流程進(jìn)行前處理和儀器檢測，獲得基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于該類樣品中有機(jī)錫化合物的定量。

2 結(jié)果和討論

2.1 特征離子對的選擇

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，首先通過單級質(zhì)譜的全掃描方式(full scan，m/z 50～550)獲得3種有機(jī)錫乙基化衍生產(chǎn)物的總離子流色譜圖(TIC)，然后在其中選擇豐度較高和質(zhì)荷比較大的離子作為母離子(parent ion);在不同碰撞能量(CE，eV)下進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描(daughters scan)，從二級質(zhì)譜圖中選擇子離子(daughter ion)及對應(yīng)碰撞能量，從而獲得特征離子對。3種有機(jī)錫化合物的串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件見表1。

表1 三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的定量離子對、定性離子對及碰撞能量Table 1 Quantitative ion pairs，qualitative ion pairs and collision energies of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide

在選定的GC-MS/MS條件下，3種有機(jī)錫化合物的乙基化衍生產(chǎn)物均可以得到良好的分離(見圖2)。

圖2 蘋果基質(zhì)中三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(加標(biāo)量200 μg/kg，以Sn計(jì))Fig.2 MRM chromatograms of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide spiked in apple at 200 μg/kg(as Sn)for each analyte

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫均為高沸點(diǎn)化合物，難以直接進(jìn)行氣相色譜分析，需要將其衍生為全有機(jī)取代的形式進(jìn)行檢測。本實(shí)驗(yàn)選取最常用的格氏試劑進(jìn)行衍生。對衍生試劑乙基溴化鎂的加入量進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果見圖3。在0.2～1.0 mL范圍內(nèi)，隨衍生試劑用量增加，目標(biāo)物響應(yīng)提高;而當(dāng)衍生試劑用量增加至2.0 mL時(shí)，3種有機(jī)錫化合物的響應(yīng)與1.0 mL時(shí)相比略有增加或下降，變化不明顯。說明1.0 mL的衍生試劑可以滿足衍生反應(yīng)的要求，因而實(shí)驗(yàn)選擇衍生試劑加入量為1.0 mL。

為了提高樣品的提取和衍生效率，在提取前采用10 mL的HCl/THF溶液對均質(zhì)的樣品進(jìn)行酸化消解。以蘋果作為代表性樣品基質(zhì)，對HCl/THF的體積比進(jìn)行了考察，結(jié)果見圖3，在HCl/THF為1∶10(v/v)的比例下，目標(biāo)物獲得最高響應(yīng)。確定HCl/THF的體積比后，對提取溶劑的類型進(jìn)行了選擇，考察了正己烷、正己烷/丙酮(1∶1，v/v)和正己烷/二氯甲烷(1∶1，v/v)3種提取溶劑，結(jié)果表明提取效果無明顯差異。最終選擇單一溶劑正己烷為提取溶劑。

水果和蔬菜中有機(jī)錫化合物的凈化常采用固相萃取的方式，最常用正相萃取柱，如硅膠或Florisil等［11，12］。本實(shí)驗(yàn)選用 Florisil柱作為凈化柱，可以有效去除基質(zhì)干擾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用正己烷進(jìn)行洗脫，需要消耗20 mL以上的溶劑，并且洗脫效率較低。而在其中添加少量丙酮(1%，v/v)，即可使得目標(biāo)物在10 mL以內(nèi)獲得完全洗脫，而且大量雜質(zhì)不會一起洗脫下來，節(jié)約有機(jī)溶劑用量。因而，實(shí)驗(yàn)選取正己烷/丙酮(99∶1，v/v)作為洗脫溶劑。

圖3 衍生試劑(EtMgBr)體積和HCl/THF的體積比對三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫響應(yīng)的影響Fig.3 Effects of EtMgBr volume and volume ratio of HCl and THF on the peak areas of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide

2.3 線性關(guān)系和檢出限

依照樣品前處理方法，以蘋果為代表性樣品基質(zhì)做基質(zhì)匹配校正曲線，選擇含量點(diǎn)包括2、5、10、20、50、100、200、500、1 000 μg/kg(以 Sn 計(jì))。以目標(biāo)物含量(μg/kg)為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;以S/N=3確定檢出限，以S/N=10確定定量限，結(jié)果見表2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，線性相關(guān)系數(shù)(r2)均不小于0.997;該方法對于三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的檢出限分別為2.0、1.5和3.4 μg/kg(以Sn計(jì))，轉(zhuǎn)換為5種有機(jī)錫農(nóng)藥的含量，該方法對三環(huán)錫、三唑錫、薯瘟錫、毒菌錫和苯丁錫的檢出限分別 6.5、7.3、5.2、4.6 和 15.1 μg/kg，完全滿足國內(nèi)外限量檢測的要求。與文獻(xiàn)［10-12］等報(bào)道的方法相比，本文所建立的方法靈敏度較高或與之相當(dāng)，加之3種有機(jī)錫農(nóng)藥可同時(shí)檢測的優(yōu)勢，使得本方法具有更廣泛的適用性。

表2 代表性樣品基質(zhì)(蘋果)中三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的線性方程、相關(guān)系數(shù)(r2)、檢出限及定量限Table 2 Linear equations，correlation coeffecients(r2)，limits of detection(LODs)and limits of quantification(LOQs)of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide in a representative matrix of apple

2.4 回收率和精密度

參照GB 2763-2012，選取其中對有機(jī)錫化合物有限量要求的5種水果和蔬菜(蘋果、梨、柑橘、西紅柿和土豆)作為樣品基質(zhì)，向其中添加10、20、50和200 μg/kg(以Sn計(jì))共4個(gè)水平的三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平設(shè)置4個(gè)平行，計(jì)算加標(biāo)回收率和精密度，具體結(jié)果見表3。結(jié)果表明，平均回收率范圍為72.4%～107.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.4%～14.2%。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)考察

由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，而且本實(shí)驗(yàn)前處理過程用到大量有機(jī)溶劑、酸和衍生試劑，可能對目標(biāo)物的響應(yīng)產(chǎn)生一定的影響。因此考察了添加200 μg/kg(以Sn計(jì))條件下，不同基質(zhì)條件對3種有機(jī)錫化合物響應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。標(biāo)準(zhǔn)品直接衍生條件下，苯丁錫的響應(yīng)較低;而經(jīng)過提取后衍生，苯丁錫的峰面積明顯提高。對不同樣品基質(zhì)而言，在柑橘基質(zhì)中，三環(huán)錫存在明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，其峰面積明顯較在其他基質(zhì)中低。

表3 5種蔬菜和水果基質(zhì)中三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的添加回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=4)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide spiked in 5 kinds of fruits and vegetables(n=4)

在基質(zhì)效應(yīng)明顯存在的情況下，本實(shí)驗(yàn)中選取基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，可以有效降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，使得定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

圖4 不同基質(zhì)條件對三環(huán)錫、三唑錫和苯丁錫響應(yīng)的影響Fig.4 Effects of different matrices on the peak areas of cyhexatin，triphenyltin and fenbutatin oxide

2.6 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用本文所建立的方法檢測了市場上隨機(jī)購買的10個(gè)蔬菜和水果樣品中的三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫殘留，樣品類型包括蘋果、梨、番茄等，結(jié)果均未檢出3種有機(jī)錫化合物。

3 結(jié)論

本文建立了水果和蔬菜中3種有機(jī)錫化合物同時(shí)檢測的格氏試劑衍生-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。與現(xiàn)有方法相比，本實(shí)驗(yàn)方法具有選擇性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，其獨(dú)特優(yōu)勢還在于實(shí)現(xiàn)了蔬菜和水果樣品中三環(huán)錫、三苯錫和苯丁錫的同時(shí)檢測，結(jié)果滿足國內(nèi)外限量標(biāo)準(zhǔn)的檢測要求，具有廣泛的適用性。

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