張志宏，朱海波，張馨月，鄧舒，劉睿智，侯毅

（1.吉林大學(xué)白求恩第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心產(chǎn)前診斷中心，長春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院泌尿外科，長春 130031）

自1992年P(guān)alermo等［1］第一次報(bào)道了卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)（ICSI）以來，解決了很多因男性因素導(dǎo)致的不育。隨著技術(shù)的發(fā)展，ICSI不但可使用新鮮的射出精子，還可以使用睪丸精子抽吸術(shù)（TESA）或經(jīng)皮附睪精子抽吸術(shù)（PESA）取出的精子，這些技術(shù)使無精子癥患者獲得其后代成為可能［2，3］。

精子發(fā)生在體內(nèi)經(jīng)過了睪丸、附睪內(nèi)一系列成熟和修飾過程，即不同來源的精子在畸形率、DNA和染色體異常、成熟度和印記基因等方面差異甚多［4］。關(guān)于不同來源精子是否會影響ICSI的治療結(jié)局，文獻(xiàn)報(bào)道不一。本文通過觀察不同來源精子行ICSI治療后的受精率、胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局情況，旨在探討不同來源精子對ICSI治療后結(jié)局的影響，為臨床無精子癥患者的ICSI治療及預(yù)后提供依據(jù)。

一、材料與方法

1.研究對象：回顧性分析2011年5月至2013年4月于我院生殖中心接受輔助生殖治療的154個(gè)ICSI周期的患者妊娠結(jié)局，均為男方因素不育。根據(jù)男方精液的來源不同，將154個(gè)ICSI周期分為3組：嚴(yán)重少、弱精子癥射出精子組（A組），即至少兩次精液常規(guī)檢查均提示精子濃度＜1×106／ml或處理后前向運(yùn)動(dòng)精子濃度＜1×106／ml的96周期（89對夫婦）；附睪精子組（B組），32周期（30對夫婦）；睪丸精子組（C組），26周期（25對夫婦）。睪丸、附睪精子組男方均為無精子癥或極度少精子癥、隱匿精子癥，取卵當(dāng)日新鮮精液無活動(dòng)精子。三組患者外周血染色體核型均正常。

本研究中，射出精子組、附睪精子組和睪丸精子組的一般情況列于表1。三組患者不育年限、內(nèi)膜厚度、移植胚胎數(shù)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；睪丸精子組女方年齡比射出精子組小（P＝0.032），與附睪精子組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.精子收集：（1）射出精子：男方清潔外陰及雙手后，手淫取精，將精液留取于無菌容器內(nèi)。液化后1，600r／min離心5min。去除上層精漿，留取離心管底部0.3ml沉淀，加入3ml Quinn’s 1006精子洗滌液（SAGE，美國）重懸離心洗滌2次，1，600r／min離心5min，備用。（2）附睪精子：術(shù)野常規(guī)消毒鋪巾，1%利多卡因局麻。10ml注射器接7號針頭，先吸取1ml Quinn’s 1006精子洗滌液，直接穿刺進(jìn)入附睪體內(nèi)，保持負(fù)壓后退出，將抽吸出的含附睪液的培養(yǎng)液置于倒置顯微鏡（×400）下，尋找精子。若見活動(dòng)精子則將培養(yǎng)液1，600r／min離心5min。去除上層液體，留取離心管底部0.3ml沉淀，加入3ml Quinn’s 1006精子洗滌液重懸離心洗滌2次，1，600r／min離心5min，備用。若多次抽吸未發(fā)現(xiàn)精子，改行睪丸穿刺取精。（3）睪丸精子：術(shù)野常規(guī)消毒鋪巾，1%利多卡因局麻。20 ml注射器直接穿刺進(jìn)入睪丸體內(nèi)，保持負(fù)壓后退出，將吸出的生精小管移入Quinn’s 1006精子洗滌液中，用1ml注射器撕碎曲細(xì)精管，倒置顯微鏡（×400）下，尋找精子。若見活動(dòng)精子則將含精子培養(yǎng)液的睪丸組織1，000r／min離心至10min，吸取上清液以1，600r／min離心5min。去除上層液體，留取離心管底部0.3ml沉淀，加入3ml Quinn’s 1006精子洗滌液重懸離心洗滌2次，1，600r／min離心5min，備用。

3.促排卵方案：常規(guī)促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRHa，默克雪蘭諾，德國）、尿人絕經(jīng)期促性腺激素（HMG，麗珠制藥）、重組人卵泡刺激素（rFSH，默克雪蘭諾，德國）方案促排卵，當(dāng)優(yōu)勢卵泡直徑≥18mm時(shí)，于當(dāng)晚注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，麗珠制藥）8，000IU，34～36h后取卵。常規(guī)雙腔取卵針穿刺雙側(cè)陰道，超聲下吸取卵泡。將獲得的卵泡液置于體式鏡（×10）下，獲取卵冠丘復(fù)合物（OCCs）。將OCCs置于 Quinn’s受精液含5%人血清白蛋白（HAS）的1020（SAGE，美國）中培養(yǎng)，2～4h后去除顆粒細(xì)胞，將 MII期卵子行ICSI。16～18h后觀察有明顯雙原核和雙極體者判斷為正常受精卵，并移入Quinn’s卵裂液含10%血清蛋白代用品（SPS）的1026（SAGE，美國）中培養(yǎng)，于第3天移入Quinn’s囊胚培養(yǎng)液含10%血清蛋白代用品（SPS）的1029（SAGE，美國）中培養(yǎng)至移植。

4.相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)：精液常規(guī)分析采用WHO第5版的標(biāo)準(zhǔn)［5］。優(yōu)質(zhì)胚胎評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：卵裂速度正常，細(xì)胞大小均一或略有不均，形狀基本規(guī)則，碎片≤20%，第2天無多核現(xiàn)象。移植后常規(guī)黃體酮（浙江仙居仙明制藥）支持，移植后14d測血HCG，確定是否生化妊娠，移植后35dB超檢查，有孕囊及心管搏動(dòng)者確定為臨床妊娠。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（ˉx±s）表示，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，率的比較采用卡方檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 射出精子組、附睪精子組和睪丸精子組的一般情況（x－±s）

二、結(jié)果

射出精子組、附睪精子組和睪丸精子組的ICSI治療后結(jié)局：附睪精子組2PN率、2PN卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、妊娠率和種植率與射出精子組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。與射出精子組比較，睪丸精子組2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均降低（P＝0.000；P＝0.000），與附睪精子組比較，睪丸精子組2PN率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均降低（P＝0.003；P＝0.000）；而與射出精子組、附睪精子組比較，睪丸精子組的2PN卵裂率、妊娠率和種植率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）（表2）。

表2 射出精子組、附睪精子組和睪丸精子組的ICSI治療結(jié)局（%）

三、討論

ICSI是治療嚴(yán)重少精子癥、弱精子癥以及梗阻和非梗阻性無精子癥等男性不育的有效手段，當(dāng)今應(yīng)當(dāng)關(guān)注的是不同來源的精子是否會影響經(jīng)輔助生殖技術(shù)治療后的胚胎發(fā)育及妊娠結(jié)局。精子從產(chǎn)生到排出體外，在體內(nèi)經(jīng)歷了睪丸、附睪內(nèi)的一系列不同成熟過程。理論上，睪丸內(nèi)的精子已經(jīng)完成了減數(shù)分裂過程，成為單倍體的遺傳配子，在一定程度上，已經(jīng)可以使卵子受精；精子在附睪中的成熟包括細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的變化，頂體外膜抗原分布改變和獲能狀態(tài)的保持等，這些變化可能會增加精子的受精能力［6］。有學(xué)者報(bào)道，與射出精子相比，用附睪、睪丸精子行ICSI，受精率無顯著差異，同時(shí)認(rèn)為只要處理精子的過程合理，ICSI過程中找到形態(tài)正常并且活動(dòng)的精子，其受精情況與精子來源并無相關(guān)性［7，8］。也有學(xué)者認(rèn)為，睪丸精子的受精率比附睪精子低，原因是睪丸精子并沒有經(jīng)過在附睪中的成熟過程，可能導(dǎo)致其激活卵子，使其授精的能力降低，但附睪精子、睪丸精子及射出精子經(jīng)過ICSI治療后妊娠結(jié)局并無顯著差異［9］。另有學(xué)者認(rèn)為，雖然用睪丸精子行ICSI后其受精率較附睪精子低，種植率卻增高，認(rèn)為睪丸精子中存在某些避免精子過度成熟的物質(zhì)［10］。

本文研究表明，睪丸精子經(jīng)ICSI治療后正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均低于射出精子及附睪精子，分析其原因可能與睪丸精子成熟度低有關(guān)。另外，睪丸精子組正常受精率低也與非梗阻性無精子癥患者堅(jiān)持拒絕供精，于取卵當(dāng)日獲得極少量精子，個(gè)別使用不活動(dòng)精子行ICSI或行ICSI時(shí)無法選擇精子形態(tài)有關(guān)。睪丸精子組優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于其他兩組，說明精子不成熟可能影響早期胚胎發(fā)育。而附睪精子組正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率與射出精子組比較無顯著差異，說明附睪精子與射出精子成熟度基本一致，可獲得與射出精子更相近的結(jié)果。而臨床上為避免造成醫(yī)源性梗阻性無精子，往往只對梗阻性無精子癥患者于取卵當(dāng)日選擇附睪穿刺。

Raman等［11］和張曄等［12］報(bào)道，行ICSI治療時(shí)射出精子和手術(shù)獲得精子的妊娠結(jié)局無明顯變化，本文研究結(jié)果與其一致。但輔助生育過程中女方年齡是影響妊娠結(jié)局的一個(gè)重要因素［13］。在無精子癥不育夫婦中，女性卵巢排卵功能和內(nèi)膜容受性大多是正常的，本研究中睪丸精子組的女方年齡較射出精子組低，但與附睪精子組相比無顯著差異，這可能是導(dǎo)致本研究中睪丸精子與附睪精子、射出精子相比妊娠率和種植率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的一個(gè)原因。今后，我們將做更多大樣本、前瞻性的相關(guān)研究。本研究表明，手術(shù)得到的精子與射出精子相比，雖然成熟度較低，相關(guān)功能可能不完整，但并不影響ICSI治療后的妊娠結(jié)局。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道，睪丸精子與附睪精子相比DNA損傷程度更低［14］；應(yīng)用附睪精子治療失敗的患者改用睪丸精子治療可獲得更高的臨床妊娠率［15］。本文研究結(jié)果進(jìn)一步證明，通過PESA或TESA得到的精子行ICSI助孕是無精子癥不育男性有效的治療手段。

染色體異?；蚧虍惓Ｊ菍?dǎo)致無精子癥的一個(gè)重要原因［16］，而ICSI可將這些遺傳缺陷傳遞給下一代。所有這些無精子患者雖然可通過PESA或TESA結(jié)合ICSI實(shí)現(xiàn)孕育后代的愿望，但也必須清楚地認(rèn)識到，ICSI本身機(jī)械性穿透卵子越過自然受精的過程，可能存在表觀遺傳學(xué)改變等風(fēng)險(xiǎn)以及其他隱患；同時(shí)ICSI可將異常精子信息傳遞給下一代，而這些異常信息無法體現(xiàn)在胚胎早期的形態(tài)學(xué)上，所以對于無精子癥患者治療前必須進(jìn)行染色體檢查、遺傳學(xué)咨詢、種植前遺傳學(xué)診斷和產(chǎn)前檢查等，避免嚴(yán)重畸形兒的出生，以達(dá)到無精子癥患者優(yōu)生優(yōu)育的治療目的。

綜上所述，盡管睪丸精子行ICSI，可能影響受精及早期胚胎發(fā)育，但與嚴(yán)重少弱精子癥患者射出精子及附睪來源的精子行ICSI相比，妊娠結(jié)局沒有顯著差異。

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