李娟娟 李燕 湯志偉

光學相干斷層掃描在視網膜缺血再灌注動物模型中的應用及評價△

李娟娟 李燕 湯志偉

光學相干斷層掃描；缺血再灌注損傷；HE染色；視網膜厚度

目的觀察視網膜缺血再灌注損傷動物模型構建后不同時間視網膜組織光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)影像學的變化及相應組織病理學改變的特點。方法采用成年SD大鼠，通過前房灌注法建立視網膜缺血再灌注損傷的動物模型，模型建立后0 h(正常對照組)、2 h、12 h、24 h、48 h、168 h分別行視網膜OCT檢查及HE染色檢查，并使用OCT測量大鼠視網膜厚度，進行統(tǒng)計學分析。結果與正常對照組相比，缺血再灌注2 h組OCT顯示各層次結構相對正常；缺血再灌注12 h、 24 h組視網膜神經上皮層水腫、厚度增加，各層結構的分界已不能清晰顯示，呈逐漸加重趨勢；48 h組水腫達高峰，至168 h組，各層結構顯示不清。缺血再灌注12 h、 24 h、48 h、168 h組視網膜厚度與正常對照組差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)，168 h組視網膜厚度明顯減少，萎縮明顯。HE染色檢查提示正常對照組各層視網膜組織排列整齊；缺血再灌注2 h組，視網膜輕度水腫，偶見視網膜神經節(jié)細胞層和內核層空泡變性；缺血再灌注12 h及24 h組視網膜神經纖維層、神經節(jié)細胞層均出現(xiàn)大量空泡，厚度增加；缺血再灌注48 h組水腫到達高峰；168 h組神經節(jié)細胞層核濃縮，缺血再灌注明顯增加，細胞數(shù)量減少、視網膜變薄。結論OCT與傳統(tǒng)的組織病理學檢查相比較，雖然不能夠提供更為詳盡的組織學資料，但在活體組織中OCT可顯示缺血再灌注損傷發(fā)生后視網膜組織結構整體的變化，無創(chuàng)簡便，在動物實驗及臨床運用上均有一定的價值。

[眼科新進展，2014，34(7):616-619，623]

視網膜缺血病變包括視網膜血管阻塞、糖尿病視網膜病變、青光眼、眼外傷等，這類疾病導致視網膜血供中斷、視網膜各層組織缺氧，當缺血因素解除、血流再灌注發(fā)生時，帶來過量的氧自由基、并造成過度的炎癥反應，啟動壞死、凋亡、自噬等多種途徑，造成視網膜神經節(jié)細胞的損傷[1]。為了更好地研究視網膜缺血再灌注后的病理損傷機制，我們通過前房灌注法建立視網膜缺血再灌注損傷的動物模型[2]，并采用頻域光學相干斷層掃描技術(special domain optical coherence tomography，SD-OCT)結合視網膜病理組織技術對缺血再灌注損傷后不同時間段的視網膜形態(tài)學變化進行動態(tài)觀察，探討光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)在視網膜缺血再灌注損傷疾病中的應用價值。

1 材料與方法

1.1實驗動物選擇4～6周齡的SD雄性大鼠30只60眼(其中實驗組25只，正常對照組5只)，體質量200～250 g，實驗前檢查雙眼前節(jié)和眼底均正常。實驗動物及實驗使用條件均符合《實驗動物管理條例》。實驗組25只大鼠再隨機分為缺血再灌注2 h組、12 h組、24 h組、48 h組、168 h組，每組5只，分籠喂養(yǎng)。

1.2動物模型建立腹腔內注射15 g·L-1戊巴比妥鈉(15～20 mg·kg-1，昆明南天化工藥業(yè))行全身麻醉；眼部滴布比卡因行局部麻醉。將麻醉成功的大鼠采取俯臥位固定于自制的大鼠固定器上，使用復方托吡卡胺散大瞳孔，5號頭皮針與生理鹽水瓶連接，將頭皮針刺入前房固定針頭，緩慢升高生理鹽水瓶使液面高至150 cm，眼壓升高至110 mmHg(1 kPa=7.5 mmHg)，持續(xù)60 min后逐漸降低輸液瓶高度至動物眼球水平，拔出前房灌注針頭，恢復視網膜血供。眼壓升高后可見大鼠角膜逐漸水腫，虹膜顏色變淺，間接檢眼鏡眼底觀察可見視網膜血供減少，視網膜血管阻斷。拔出針頭后可見大鼠角膜逐漸恢復透明，虹膜顏色逐漸恢復，視網膜逐漸恢復紅潤，實現(xiàn)再灌注。視網膜出現(xiàn)上述表現(xiàn)證明造模成功。

1.3大鼠視網膜OCT檢查分別于視網膜缺血再灌注動物模型建立后0 h(即正常對照組)、2 h、12 h、24 h、48 h、168 h(每個時間段5只大鼠)對大鼠進行腹腔麻醉，之后用復方托吡卡胺散瞳，將大鼠眼部固定于OCT掃描儀(Heidelberg HRA2，德國)下頜架前合適位置，并使用顯微有齒鑷夾住結膜，調整瞳孔至合適位置，行視網膜SD-OCT掃描。掃描參數(shù)為:掃描長度2～8 mm，掃描深度2～4 mm，掃描部位為視盤顳側、鼻側、上方、下方1個視盤直徑處視網膜。每只動物重復掃描5次，選擇圖像質量與位置較佳者進行標記保存，分析不同時間段缺血再灌注大鼠動物模型中視網膜OCT影像學圖像變化特征。運用OCT掃描儀測量上述四個部位視網膜厚度，每個點測量3次后取平均值，與正常大鼠視網膜進行對照。

1.4大鼠視網膜病理切片檢查視網膜缺血再灌注2 h、12 h、24 h、48 h、168 h組于OCT檢查之后行腹腔注射過量麻醉藥物處死大鼠，摘除眼球、標記方向。將眼球置于福爾馬林溶液內固定48 h，去除角膜和晶狀體；依次梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋。修整蠟塊，作平行于晶狀體前后表面經線方向的切片，切片厚4～5 μm。去除含有視神經的切片，每個標本選擇兩個切片行常規(guī)HE染色。脫蠟、蘇木素染色、伊紅染色、梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察視網膜組織病理變化，重點觀察神經節(jié)細胞的損傷情況。與正常對照組大鼠及上述OCT檢查結果進行對比分析。

2 結果

2.1大鼠視網膜缺血再灌注損傷模型建立情況實驗組大鼠經眼底間接檢眼鏡對虹膜和視網膜的觀察證實所有大鼠均實現(xiàn)了視網膜缺血再灌注(圖1-圖3)，成功率達100%，無屈光介質受損、感染、實驗動物死亡等并發(fā)癥的發(fā)生。

2.2各組大鼠視網膜OCT檢查結果分析正常對照組大鼠視網膜OCT圖像:可以較為清晰地顯示視網膜神經上皮層及RPE細胞層，其中神經上皮層中各層結構清晰、形態(tài)正常(圖4A)。實驗組大鼠視網膜OCT圖像:缺血再灌注2 h組OCT顯示各層次結構較正常對照組清晰，但整個神經上皮層的厚度增厚，以內叢狀層及內核層的增厚最為明顯，兩層之間的分界仍然清晰可見(圖4B)。缺血再灌注12 h組及24 h組，OCT顯示視網膜神經上皮層繼續(xù)變得水腫、厚度增加，這兩組神經上皮層間各層結構的分界已不能清晰顯示(圖4C-圖4D)。缺血再灌注48 h組水腫達到高峰，至168 h時，視網膜神經上皮層的厚度明顯變薄，其間各層結構仍然顯示不清(圖4E-圖4F)。

2.3視網膜厚度的統(tǒng)計學分析OCT所測各組大鼠視網膜厚度見表1。總體變化規(guī)律為缺血再灌注2 h至24 h組視網膜厚度和正常對照組相比均增加，48 h組到達高峰，168 h組低于正常對照組。缺血再灌注2 h組與正常對照組視網膜厚度差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；缺血再灌注12 h、24 h、48 h、168 h組與正常對照組視網膜厚度差異均有統(tǒng)計學意義(均為P<0.05)。

2.4各組大鼠視網膜組織病理檢查結果分析正常對照組大鼠視網膜HE染色結果顯示，大鼠視網膜結構分為十層，各層視網膜組織排列整齊，主要分界清楚的三層細胞為:視網膜神經節(jié)細胞、內核層細胞、外核層細胞，其中視網膜神經節(jié)細胞為最內層的單層細胞，細胞核較大，染色較淡；內核層和外核層形態(tài)較為相似，均為多層細胞構成，細胞核小且圓、核染色較深(圖5A)。實驗組大鼠視網膜HE染色結果顯示:與正常對照組相比，缺血再灌注2 h組大鼠視網膜輕度水腫，偶見視網膜神經節(jié)細胞層和內核層空泡變性、間質疏松；總體而言結構完整，未見顯著差異(圖5B)。缺血再灌注12 h及24 h組:視網膜神經纖維層、神經節(jié)細胞層出現(xiàn)大量空泡；內外叢狀層明顯疏松、厚度增加，神經節(jié)細胞數(shù)量減少；內核層排列不規(guī)整，細胞間疏松排列(圖5C-圖5D)。缺血再灌注48 h組:視網膜神經纖維層、內叢狀層空泡明顯，水腫到達高峰；視網膜神經節(jié)細胞層開始出現(xiàn)核濃縮，數(shù)量明顯減少；內核層排列紊亂，細胞數(shù)量減少；外核層也開始出現(xiàn)排列不規(guī)則、數(shù)量減少；視網膜可觀察到炎性細胞浸潤(圖5E)。缺血再灌注168 h組:神經纖維層水腫減輕、厚度變薄，神經節(jié)細胞數(shù)十分稀少、散在分布，各層細胞核濃縮明顯增加，細胞排列紊亂，視網膜正常結構層次基本消失(圖5F)。

Figure 1 Iris blood vessels in normal rats was reticular distributed,the vascular morphology was normal and distributed to the pupil.Figure 2 Most of the iris vessels following anterior chamber perfusion became occlusion,only a few larger vessels was seen and conjunctival tissue was pale.Figure 3 Iris vessels after reperfusion was reperfused,vascular was significant engorgement with hyperemia 圖1 正常實驗組大鼠虹膜血管分布:可見虹膜血管呈網狀均勻分布，血管形態(tài)正常，向瞳孔區(qū)走形。圖2 前房灌注下虹膜血管:大部分虹膜血管閉塞，僅隱見數(shù)支較大血管，整個虹膜組織及球結膜組織蒼白。圖3 再灌注后虹膜血管:可見虹膜血管重新充盈，血管怒張，充血狀態(tài)明顯

Figure 4 OCT images of rat retinal in each group.A:Normal rat;B:2 hours after ischemia-reperfusion group;C:12 hours after ischemia-reperfusion group;D:24 hours after ischemia-reperfusion group;E:48 hours after ischemia-reperfusion group;F:168 hours after ischemia-reperfusion group 各組大鼠視網膜OCT圖像。A:正常對照組；B:缺血再灌注2 h組；C:缺血再灌注12 h組；D:缺血再灌注24 h組；E:缺血再灌注損傷48 h組；F:缺血再灌注損傷168 h組

表1 各組視網膜厚度Table 1 Retinal thickness in each group(±s，l/μm)

3 討論

OCT是上世紀90年代發(fā)展起來的一種光學儀器，可提供分辨活體組織的斷層圖像，并可以依靠所知或推斷的組織反射來測量組織的厚度或距離[3]。OCT作為一種非侵入、非接觸、高分辨率的定性定量檢測方法，在視網膜疾病的評估方面有著特別的應用價值[4]，而目前文獻尚無運用OCT技術檢測缺血再灌注損傷性視網膜疾病的報道。本研究通過前房灌注法建立視網膜缺血再灌注動物損傷模型[5]，在損傷后不同時間使用OCT測量視網膜厚度，同時使用傳統(tǒng)病理檢查技術對比分析視網膜組織病理變化。初步探討OCT技術在缺血再灌注損傷疾病中的應用價值。

Figure 5 Optical microscopy images of rat retina(HE,×200).A:Normal rat;B:2 hours after ischemia-reperfusion group;C:12 hours after ischemia-reperfusion group;D:24 hours after ischemia-reperfusion group;E:48 hours after ischemia-reperfusion group;F:168 hours after ischemia-reperfusion group 各組大鼠視網膜光學顯微鏡圖像(HE，×200)。A:正常對照組；B:缺血再灌注 2 h組；C:缺血再灌注 12 h組；D:缺血再灌注 24 h組；E:缺血再灌注 48 h組；F:缺血再灌注 168 h組

視網膜缺血再灌注損傷不同時間OCT掃描結果顯示:正常對照組大鼠視網膜OCT圖像可以較為清晰地顯示視網膜的神經上皮層、RPE細胞層，神經上皮層結構清晰、形態(tài)正常[6]。缺血再灌注2 h組OCT顯示各層次結構相對正常對照組而言基本可以分辨清楚，但整個神經上皮層的厚度輕微增厚，以內叢狀層及內核層的增厚較為明顯，兩層之間的分界仍然清晰可見；結合該時間組大鼠視網膜病理切片觀察到的結果，缺血再灌注損傷發(fā)生后2 h，內叢狀層及內核層開始出現(xiàn)空泡樣變，間質疏松。以上研究證實在缺血再灌注損傷早期，即開始出現(xiàn)視網膜組織的病理損害，組織結構以水腫為主要表現(xiàn)，損傷部位主要發(fā)生在視網膜內層[7]。

隨著病變的進展，缺血再灌注損傷發(fā)生后12 h及24 h，OCT顯示視網膜神經上皮層繼續(xù)變得水腫、厚度增加，神經上皮層間各層結構的分界已不能清晰顯示；結合這兩個時間點的組織病理切片結果發(fā)現(xiàn)，視網膜神經纖維層、神經節(jié)細胞層均出現(xiàn)大量空泡，內外叢狀層明顯疏松、厚度增加，48 h時視網膜厚度繼續(xù)增加，而結構也不能清晰顯示的原因可能是由于此時多種途徑產生的大量氧自由基誘導出一系列鏈式反應，通過破壞細胞膜屏障、改變細胞膜滲透性、降低酶活性等多種途徑對視網膜組織和細胞造成結構和功能的顯著改變，氧自由基的積蓄、炎癥反應的程度都達到缺血再灌注損傷過程的最高點[8-9]。因此我們認為，缺血再灌注發(fā)生24 h是損害作用產生的高峰期，這一研究結果將用于下部分干預實驗中。

當病變進入48 h后，OCT掃描結果顯示在缺血再灌注損傷48 h、168 h時，視網膜神經上皮層的厚度開始變薄，其間各層結構仍然顯示不清。病理檢查結果顯示，視網膜神經節(jié)細胞層開始出現(xiàn)核濃縮。在此階段中氧自由基、炎癥反應、興奮性氨基酸的毒性作用、鈣超載等啟動了多途徑的細胞壞死、凋亡，導致了最終的形態(tài)破壞及功能損傷[10]。

在缺血再灌注損傷各個時間點對視網膜色素上皮層厚度及形態(tài)的觀察結果顯示色素上皮層的變化并不明顯，厚度測量無統(tǒng)計學差異、形態(tài)觀察與正常對照組相比并未出現(xiàn)異常。視網膜色素上皮層病變不明顯的原因考慮為:本模型通過前房灌注制造高眼壓，高眼壓主要影響視網膜中央動脈系統(tǒng)的血液供應，而視網膜中央動脈系統(tǒng)供應視網膜內層結構，視網膜色素上皮層屬于視網膜外層，其供血主要來自脈絡膜組織，故在此模型中，它的病變并不明顯[11]。病理學檢查結果也證實了這一結論。

我們對比觀察了OCT與視網膜病理切片的檢查結果，從病理形態(tài)的準確性及精確性而言，OCT所提供的影像學信息遠遠不能同病理切片相提并論，但我們認為作為一種無創(chuàng)性檢查，OCT在臨床上對于缺血再灌注損傷性疾病仍然有著其特有的使用價值:(1)OCT能精確測量視網膜厚度變化，從而提示病變進展的程度，是處于氧自由基和炎癥反應的高峰期，還是已經進入病變的萎縮期，從而指導不同階段的治療策略，并對治療效果進行監(jiān)測；對于組織厚度的測量，OCT測量對象為活體，而病理方法測量標本經過脫水等處理環(huán)節(jié)，測量值相對變小，因此OCT更接近真實厚度[12]；(2)OCT能在視網膜結構層次的改變方面提供影像學信息，幫助我們認識病變不同階段造成視網膜損傷的部位、程度；(3)OCT無創(chuàng)傷、可重復性好，加上目前已經十分成熟的追蹤系統(tǒng)，OCT可提供患者疾病的動態(tài)觀察；(4)對于活體組織，進行精細的病理學檢查并不可行，OCT雖不能提供精細的病變特征，僅能從整體上反映病變程度，但隨著OCT技術的進展，它與病理學之間的差距將會越來越小，具有廣闊的應用前景[13]；(5)在實驗動物的研究中，OCT可對一個研究對象提供連續(xù)的觀察結果，改變了傳統(tǒng)病理檢查只能提供一個時間點的觀察結果，減少了動物的使用量，避免了重復而繁瑣的實驗步驟，節(jié)省了成本，提高了效率。

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date:Dec 17,2013

National Natural Science Foundation of China(No:81360204)From theDepartmentofOphthalmology,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity(LI Juan-Juan,LI Yan),Kunming650031,YunnanProvince,China;DepartmentofNeurosurgery,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity(TANG Zhi-Wei),Kunming650021,YunnanProvince,China

Application of optical coherence tomography in rat retinal ischemia reperfusion injury models

LI Juan-Juan,LI Yan,TANG Zhi-Wei

optical coherence tomography；retinal ischemic reperfusion injury；HE staining；retinal thickness

ObjectiveTo observe the changes of retinal morphology and pathologic characteristics in retinal ischemic reperfusion injury (RIRI) animal model by optical coherence tomography (OCT).MethodsTransient ischemia was induced in SD mice by raising intraocular pressure to 110 mmHg (1 kPa=7.5 mmHg) for 60 minutes followed by retinal reperfusion by restoring normal pressure.At 0 hour (normal control group),2 hours,12 hours,24 hours,48 hours and 168 hours after RIRI,retinal changes were monitored by histological assessment with HE staining and SD-OCT scanning.The retinal thickness was measured.ResultsOCT showed the each layer of retina was relatively normal at 2 hours after RIRI,the nerve epithelial layer was became edema and thickened at 12 hours and 24 hours after RIRI,and the boundary layers of the structure could not be shown clearly.The edema reached peak at 48 hours after RIRI,and each layer could not be shown clearly until 168 hours after RIRI.Compared with normal control group,there were statistical differences in retinal thickness at 12 hours,24 hours,48 hours and 168 hours after RIRI (allP<0.05),the retinal thickness at 168 hours was decreased and thinned obviously.Pathological examination showed the retinal edema and occasionally retinal ganglion cell layer and inner nuclear layer degeneration appeared,a large vacuoles in retinal nerve fiber layer and ganglion cell layer formed with increased thickness at 12 hours and 24 hours after RIRI,and the edema peaked at 48 hours after RIRI.With the disease retinal ganglion cell layer began nuclear enrichment,the nuclear enrichment significantly increased,the retinal cells were obviously decreased,and the retina became thinner at 168 hours after RIRI.ConclusionCompared with conventional histopathology,OCT can’t provide more detailed histological data,but in the living tissues OCT can disclose the changes in the overall organizational structure of retina after injury,as a non-invasive and easy method,OCT have some values in animal experiments and clinical application.

李娟娟，女，1980年出生，在讀博士研究生。研究方向為玻璃體視網膜疾病。聯(lián)系電話:0871-65156650-3084(O)；E-mail:ljj800-502@163.com

AboutLIJuan-Juan:Female,born in 1980.Doctor degree.Tel:+86-871-65156650-3084(O)；E-mail:ljj800502@163.com

2013-12-17

國家自然科學基金資助(編號:81360204)

650031 云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科(李娟娟，李燕)；650021 云南省昆明市，昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院神經外科(湯志偉)

李燕，E-mail:liyanr@hotmail.com

李娟娟，李燕，湯志偉．光學相干斷層掃描在視網膜缺血再灌注動物模型中的應用及評價[J]．眼科新進展，2014，34(7)：616?619，623．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0169

【實驗研究】

修回日期:2014-02-28

本文編輯:付中靜

Accepteddate:Feb 28,2014

Responsibleauthor:LI Yan，E-mail:liyanr@hotmail.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):616-619，623]