陳華艷 尹延彥 葉凡 ?？?biāo) 王蕾

微波熱療增強(qiáng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤化學(xué)治療效應(yīng)的體外研究△

陳華艷 尹延彥 葉凡 常俊標(biāo) 王蕾

微波熱療；視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤；化療；阿霉素

目的研究微波熱療對(duì)提高阿霉素(doxorubicin，DOX)體外抑制人RB Y79細(xì)胞的作用。方法分別使用MTT法、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)人RB Y79細(xì)胞的存活率、攝取及凋亡情況；使用分光光度法檢測(cè)Y79細(xì)胞內(nèi)Caspase-3的活性。將實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、DOX組、微波熱療組、DOX+微波熱療組，分別將4組進(jìn)行以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。結(jié)果DOX+微波熱療組與其他組相比細(xì)胞存活率明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。細(xì)胞熒光攝取實(shí)驗(yàn)表明，DOX+微波熱療組與DOX組相比，其細(xì)胞穿透效果在60 min內(nèi)呈明顯上升趨勢(shì)。DOX+微波熱療組72 h細(xì)胞凋亡率可達(dá)(49.08±1.02)%，可有效促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與其他各組相比差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)。同時(shí)，DOX組、微波熱療組、DOX+微波熱療組、空白對(duì)照組人RB Y79細(xì)胞的Caspase-3活性分別為2.88±0.16、1.61±0.09、4.67±0.27、1.00±0.05，微波熱療+DOX可以有效提升細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性，與其余各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。結(jié)論微波熱療可以有效提高人RB Y79細(xì)胞體外化學(xué)治療的效果，此療法是一種很有前景的治療視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的方法。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(7):620-623]

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是一種起源于視網(wǎng)膜胚胎性核層細(xì)胞的惡性腫瘤，也是嬰幼兒時(shí)期眼內(nèi)惡性程度最高的腫瘤[1]。RB經(jīng)過早期保守治療后生存率可顯著提高[2]。目前，RB常用的治療手段主要有放射療法、化學(xué)療法、分子基因療法等[3-5]。熱療是近年發(fā)展起來的一種治療癌癥的新方法，是利用外加能量使腫瘤溫度上升至有效治療溫度殺滅腫瘤細(xì)胞。阿霉素(doxorubicin，DOX)是目前臨床常用的一種廣譜抗癌藥，具有熱療增敏性和pH敏感性[6]。研究表明，熱療與化學(xué)治療聯(lián)合可以起到協(xié)同增效的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討微波熱療對(duì)RB Y79細(xì)胞的DOX化學(xué)治療增敏作用。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器DOX(美國(guó)Aldrich Sigma公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)、胎牛血清(四季青公司)、四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國(guó)Hyclone公司)、細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)、人 RB Y79 細(xì)胞(美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù))。酶標(biāo)儀(加拿大DYNEX公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)、UHR-2000高能聚束微波熱療機(jī)(華源醫(yī)療設(shè)備有限公司)、高效液相色譜儀(島津公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)將RB Y79細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)箱條件為37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5% CO2。細(xì)胞接種24 h后，使用工作濃度的DOX與培養(yǎng)基混合液作為細(xì)胞培養(yǎng)液，在42 ℃條件下微波加熱2 h，然后繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h或72 h。

1.3DOX工作濃度測(cè)定DOX設(shè)0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、1.000 mg·L-1、2.000 mg·L-1、4.000 mg·L-1、8.000 mg·L-17組，每組3個(gè)復(fù)孔，使用MTT法測(cè)定細(xì)胞抑制率，以48 h的IC50為工作濃度。

1.4MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖率將RB Y79細(xì)胞以每孔5.5×103個(gè)接種到96孔培養(yǎng)板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h。實(shí)驗(yàn)組分為空白對(duì)照組、DOX組、微波熱療組和DOX+微波熱療組(使用工作濃度的DOX與培養(yǎng)基混合液作為細(xì)胞培養(yǎng)液，在42 ℃條件下微波加熱2 h)。終止培養(yǎng)前4 h，每孔加MTT 10 μL。4 h后，每孔加入150 μL三聯(lián)液，室溫孵育過夜。第2天，全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀測(cè)定每孔的 570 nm 波長(zhǎng)吸光度(A)值，重復(fù)測(cè)量3次。計(jì)算公式:細(xì)胞存活率=(1-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%。

1.5DOX細(xì)胞熒光攝取檢測(cè)將密度為0.15×106個(gè)/孔的Y79細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入1.3 mg·L-1DOX進(jìn)行刺激(此濃度為IC50計(jì)算出的濃度)，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組、微波熱療組、DOX組及DOX+微波熱療組，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。每組分別培養(yǎng)5 min、30 min、60 min。培養(yǎng)完畢后，棄培養(yǎng)液，PBS沖洗后并固定細(xì)胞，置于熒光顯微鏡下檢測(cè)。

1.6細(xì)胞凋亡率檢測(cè)分組方法參照1.5，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，使用PBS洗滌3次；加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混勻；再加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫、避光反應(yīng)5～15 min；1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7Caspase-3活性檢測(cè)分組方法參照1.5，于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞重新懸浮于 50 μL冷細(xì)胞裂解緩沖液中，冰上放置10 min。4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，置于冰上。向每組加入50 μL的2×反應(yīng)緩沖液/二硫蘇糖醇(DTT)混合液。向每管加入5 μL 1 mmol·L-1Caspase-3底物，水浴37 ℃孵育1 h。在405 nm波長(zhǎng)下讀取A值。根據(jù)試劑盒說明所得斜率值計(jì)算 Caspase-3活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單向方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DOX工作濃度的確定MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，0.125 mg·L-1、0.250 mg·L-1、0.500 mg·L-1、1.000 mg·L-1、2.000 mg·L-1、4.000 mg·L-1、8.000 mg·L-1DOX分別作用于人RB Y79細(xì)胞后，各組細(xì)胞抑制率分別為(3.56±0.29)%、(9.74±0.91)%、(26.88±2.31)%、(34.75±3.24)%、(59.62±4.28)%、(76.71±4.54)%、(95.04±5.27)%。人RB Y79細(xì)胞對(duì)DOX的IC50為1.3 mg·L-1，并以此藥物濃度進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

2.2各組細(xì)胞的增殖率細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h及72 h后，抑制率出現(xiàn)明顯變化(表1)。DOX+微波熱療組與空白對(duì)照組相比，24 h、48 h及72 h差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；與微波熱療組相比，24 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，48 h及72 h時(shí)差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)；與DOX組相比，24 h、48 h及72 h差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

表1 各組人RB Y79細(xì)胞存活率Table 1 Cell viability for human RB Y79 cells(±s，rate/%)

2.3微波熱療促進(jìn)細(xì)胞對(duì)DOX的攝取經(jīng)微波熱療處理后，細(xì)胞內(nèi)DOX的熒光明顯增強(qiáng)。在60 min中人RB Y79細(xì)胞中沒有明顯的紅色熒光，但是經(jīng)過微波處理后的細(xì)胞在微波熱療5 min后，就開始有紅色熒光出現(xiàn)。60 min時(shí)已經(jīng)可以看到細(xì)胞內(nèi)明顯的紅色熒光(圖1)。結(jié)果表明，微波熱療可以提高人RB Y79細(xì)胞對(duì)DOX的穿透及蓄積能力。

Figure 1 Fluorescent microscopic images of cells in DOX group and DOX combined with microwave treatment(×400) DOX組及DOX+微波熱療組的細(xì)胞明場(chǎng)及熒光圖片(×400)

表2 人RB Y79細(xì)胞在24 h、48 h和72 h的凋亡率Table 2 Apoptotic rate of human RB Y79 cells at 24 hours,48 hours and 72 hours(±s)

2.4微波熱療促進(jìn)DOX化學(xué)治療對(duì)細(xì)胞的凋亡DOX組、微波熱療組及DOX+微波熱療組細(xì)胞凋亡率均較空白對(duì)照組明顯升高(均為P<0.01，見表2)；DOX+微波熱療組的細(xì)胞凋亡率較DOX組、微波熱療組的凋亡率均有明顯升高(均為P<0.01)。

2.5微波熱療誘導(dǎo)人RBY79細(xì)胞中的Caspase-3的作用按照實(shí)驗(yàn)操作處理24 h后，DOX組、微波熱療組、DOX+微波熱療組、空白對(duì)照組人RB Y79細(xì)胞的Caspase-3活性分別為2.88±0.16、1.61±0.09、4.67±0.27、1.00±0.05，DOX+微波熱療組人RB Y79細(xì)胞的Caspase-3活性增強(qiáng)，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

3 討論

DOX是目前臨床常用的一種廣譜抗癌藥，可用于多種腫瘤的治療[8-10]。DOX在進(jìn)行腫瘤化學(xué)治療時(shí)具有明顯的熱療增敏性和pH敏感性，將熱療與化學(xué)治療聯(lián)合應(yīng)用可以對(duì)化學(xué)治療起到增效作用[11]。腫瘤組織及其周圍血管對(duì)溫度具有敏感性，利用微波熱療的方法可有效將其殺滅[12]。近年來，腫瘤熱療受到了人們的廣泛關(guān)注。同時(shí)，熱療和化學(xué)治療聯(lián)合治療腫瘤具有明顯的增強(qiáng)作用，其原因可能是熱療使藥物滲入細(xì)胞量增加、蛋白質(zhì)變性及化學(xué)治療藥物的藥動(dòng)學(xué)改變等。本研究探討了微波熱療對(duì)DOX進(jìn)入細(xì)胞的促進(jìn)作用，結(jié)果表明，經(jīng)過微波和DOX共同作用的細(xì)胞，在作用5 min后，細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)明顯的熒光，表明微波熱療可以有效促進(jìn)DOX快速進(jìn)入靶細(xì)胞。

研究者認(rèn)為熱療殺滅細(xì)胞的臨界溫度為42 ℃[13]，目前臨床所使用的熱療溫度多數(shù)在41～43 ℃之間，因此本研究中微波熱療的處理溫度設(shè)定為42 ℃。張福明等[6]使用KG-1a細(xì)胞研究了熱療對(duì)DOX治療的增敏作用，發(fā)現(xiàn)熱療可以增加DOX對(duì)KG-1a細(xì)胞的殺傷作用，提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果表明40 ℃、42 ℃熱療聯(lián)合化學(xué)治療組的細(xì)胞抑制率明顯高于化學(xué)治療組和單純熱療組(均為P<0.01)。各處理組的細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，40 ℃、42 ℃熱療聯(lián)合化學(xué)治療組細(xì)胞凋亡率明顯高于化學(xué)治療組和單純熱療組(均為P<0.01)。王向軍等[14]研究了DOX對(duì)U251神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞在熱療條件下的增敏作用，結(jié)果表明熱療聯(lián)合DOX化學(xué)治療能增強(qiáng)對(duì)U251細(xì)胞的體外抑制作用，提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率，通過聯(lián)合熱療有效下調(diào)P-gp及Bcl-2蛋白的表達(dá)，提高U251細(xì)胞對(duì)DOX化學(xué)治療的敏感性。以上實(shí)驗(yàn)均證明DOX本身具有熱療增敏特性，但是熱療的方法與本研究不同，本研究使用的是微波熱療。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在聯(lián)合微波熱療的條件下，DOX可迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此熱療方法與其他熱療方法相比優(yōu)勢(shì)明顯:首先此熱療方法已用于臨床腫瘤的相關(guān)治療；其次，微波熱療法可以有效穿透人體組織，達(dá)到治療人體深層腫瘤的目的；并且，此熱療法可使病變部位快速達(dá)到指定溫度，從而減少患者的痛苦。

本研究結(jié)果表明，微波熱療不僅可以有效促進(jìn)DOX快速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并且可以有效協(xié)同DOX增強(qiáng)細(xì)胞抑制率，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。凋亡是由Caspases家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程，即Caspase在凋亡誘導(dǎo)信號(hào)的作用下，啟動(dòng)型Caspases先通過結(jié)合特異輔因子激活，發(fā)揮水解蛋白的作用，從而激活下游效應(yīng)型Caspases，一旦效應(yīng) Caspases被激活，便大范圍水解細(xì)胞內(nèi)的靶物質(zhì)，從而降解細(xì)胞內(nèi)蛋白，最終使細(xì)胞進(jìn)入不可逆死亡階段[15]。Caspase-3是白細(xì)胞介素 1-β轉(zhuǎn)化酶家族成員之一，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”[16]?；罨蟮腃aspase-3酶解切割DNA依賴的蛋白激酶和聚腺苷二磷酸核糖多聚酶等，從而影響DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和損傷修復(fù)[17]。本研究通過對(duì)人RB Y79細(xì)胞中Caspase-3活性的考察，探討了微波熱療對(duì)Caspase-3活性的促進(jìn)作用，抗腫瘤機(jī)制的重點(diǎn)是使細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，而激活Caspase-3在腫瘤凋亡作用中具有重要意義。

本研究不僅證實(shí)了微波熱療對(duì)DOX體外抗腫瘤的協(xié)同作用，可以有效協(xié)同DOX抑制Y79細(xì)胞的增殖，并且能有效促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，提高了Y79細(xì)胞對(duì)DOX化療的敏感性，這為RB的治療提供了一種有效的治療手段。

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date:Dec 7，2013

Youth National Nature Science Foundation of China(No:81302717)From theSchoolofBasicMedicine，ZhengzhouUniversity(CHEN Hua-Yan)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；CollegeofPublicHealth，ZhengzhouUniversity(YIN Yan-YannowworksattheDepartmentofPublicHealth，XinxiangMedicalUniversity)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；SchoolofPharmaceuticalSciencesofZhengzhouUniversity(YE Fan)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China；SchoolofChemistryandMolecularEngineering，ZhengzhouVnirersity(CHANG Jun-Biao),Zhengzhou450001,HenanProvince,China;SchoolofChemistryandMolecularEngineering，SchoolofPharmaceuticalSciences，ZhengzhouUniversity(WANG Lei)，Zhengzhou450001，HenanProvince，China

Microwave hyperthermia enhancing chemotherapeutic efficacy in retinoblastoma cells in vitro

CHEN Hua-Yan，YIN Yan-Yan，YE Fan，CHANG Jun-Biao,WANG Lei

microwave hyperthermia；retinoblastoma；chemotherapy；doxorubicin

ObjectiveTo study the ability of microwave hyperthermia in enhancing chemotherapeutic efficacy of doxorubicin (DOX) against human retinoblastoma Y79 cellsinvitro.MethodsMTT method was used to detect the viability of Y79 cells,cellular uptake of Y79 cells was determined by fluorescence microscopy,cell apoptosis was detected by flow cytometry,and spectrophotometric method was used to detect the expression of Caspase-3 in Y79 cells.The experiments were divided into 4 groups:blank control group,DOX group,microwave treatment group and DOX combined with microwave treatment group,and these groups were experimented,respectively.ResultsThe Y79 cells exposed to DOX with microwave treatment showed a significant decrease in cell viability which compared with other groups (allP<0.05).The cellular uptake results showed that the cells increased permeability to DOX immediately with the addition of microwave compared with DOX alone,which continued to increase over 60 minutes.Apoptotic rate of cells treated with DOX and microwave hyperthermia was (49.08±1.02)%,and it could enhance the apoptosis rate compared to other experimental groups (allP<0.01).Meanwhile,the activity of Caspase-3 in cells of blank control group,DOX group,microwave treatment group and DOX combined with microwave treatment group were 2.88±0.16,1.61±0.09,4.67±0.27 and 1.00±0.05,respectively,DOX with microwave treatment could enhance the activity of Caspase-3 in cells,there were statistical differences compared with other groups (allP<0.05).ConclusionMicrowave hyperthermia can enhance the chemotherapeutic efficacy against retinoblastoma Y79 cellsinvitro,DOX combined with microwave treatment is a promising approach for retinoblastoma.

陳華艷，女，1969年7月出生，實(shí)驗(yàn)技師。聯(lián)系電話:15136400500；E-mail:15136400500@139.com

AboutCHENHua-Yan:Female，born in July，1969.Tel:1513640-0500；E-mail:15136400500@139.com

2013-12-07

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(編號(hào):81302717)

450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(陳華艷)；450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院(尹延彥現(xiàn)工作于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系)；450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)藥學(xué)院(葉凡)；450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院(?？?biāo))；450001 河南省鄭州市，鄭州大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院、鄭州大學(xué)藥學(xué)院(王蕾)

王蕾，E-mail:hahalei@139.com

陳華艷，尹延彥，葉凡，?？?biāo)，王蕾．微波熱療增強(qiáng)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤化學(xué)治療效應(yīng)的體外研究[J]．眼科新進(jìn)展，2014，34(7)：620?623．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0170

【實(shí)驗(yàn)研究】

修回日期:2014-03-10

本文編輯:付中靜

Accepteddate:Mar 10，2014

Responsibleauthor:WANG Lei，E-mail:hahalei@139.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):620-623]