張紅敏 劉素素 李金 柳慧 謝艷亭 王麗婭

雙氯芬酸鈉對(duì)小鼠真菌性角膜炎抗真菌療效的影響△

張紅敏 劉素素 李金 柳慧 謝艷亭 王麗婭

真菌性角膜炎；雙氯芬酸鈉；酮康唑；中性粒細(xì)胞；鼠

目的觀察抗真菌藥物聯(lián)合雙氯芬酸鈉對(duì)真菌性角膜炎的治療效果。方法選取C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以腐皮鐮孢菌性角膜炎為模型。實(shí)驗(yàn)分為4組:手術(shù)對(duì)照組(不進(jìn)行菌絲接種)、模型組、酮康唑組(單純酮康唑治療)和雙氯芬酸鈉組(酮康唑聯(lián)合雙氯芬酸鈉治療)。每組于造模后1 d、2 d、3 d、4 d和5 d分別進(jìn)行裂隙燈觀察和活體共焦顯微鏡檢查。裂隙燈下進(jìn)行角膜病變嚴(yán)重程度臨床評(píng)分；對(duì)活體共焦顯微鏡圖片進(jìn)行菌絲定量和炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)。手術(shù)對(duì)照組和雙氯芬酸鈉組于手術(shù)后5 d進(jìn)行角膜HE染色病理學(xué)檢查。結(jié)果模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組與手術(shù)對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)角膜臨床評(píng)分均有顯著性增加(均為P<0.01)；雙氯芬酸鈉組5 d與模型組相比，臨床評(píng)分顯著增加(P<0.01)；雙氯芬酸鈉與酮康唑組相比，3 d、4 d和5 d的角膜臨床評(píng)分顯著增加(均為P<0.01)。模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組3 d后角膜內(nèi)菌絲消失；雙氯芬酸鈉組與模型組和酮康唑組相比，角膜內(nèi)菌絲面積無(wú)明顯變化(均為P>0.05)。模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組與手術(shù)對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)角膜炎癥細(xì)胞數(shù)均有顯著增多(均為P<0.01)；酮康唑組與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)炎癥細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(均為P>0.05)；雙氯芬酸鈉組與模型組和酮康唑組相比，炎癥細(xì)胞數(shù)目4-5 d均有顯著性增多(均為P<0.01)。雙氯芬酸鈉組角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與角膜臨床評(píng)分的Pearson相關(guān)分析顯示，二者呈明顯正相關(guān)(r=0.860，P=0.000)。造模后5 d，手術(shù)對(duì)照組和雙氯芬酸鈉組HE病理學(xué)檢查結(jié)果顯示:手術(shù)對(duì)照組角膜基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞很少；雙氯芬酸鈉組基質(zhì)增厚，基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多，基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)顯示，可以確認(rèn)的中性粒細(xì)胞占基質(zhì)所有細(xì)胞總數(shù)的72.67%。結(jié)論小鼠真菌性角膜炎進(jìn)行抗真菌藥物治療的同時(shí)局部應(yīng)用雙氯芬酸鈉，不但不能減輕角膜病變的嚴(yán)重程度，反而增加了真菌性角膜炎的臨床評(píng)分，增加了角膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主。提示進(jìn)行真菌性角膜炎治療時(shí)，慎用雙氯芬酸鈉。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(7):607-611]

真菌性角膜炎是由真菌感染引起的一種嚴(yán)重的感染性角膜病，近年來(lái)其在我國(guó)發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)，已成為角膜盲的首位病因[1]。真菌性角膜炎的臨床治療非常棘手，主要原因是:(1)供臨床應(yīng)用的療效確切的眼表用抗真菌藥物很少，常用的那他霉素滴眼液不但價(jià)格昂貴，而且約有46.6%的鐮孢菌患者對(duì)該藥不敏感[2]，而鐮孢菌屬恰恰是在我國(guó)占真菌性角膜炎菌種首位的[1]，因此，該藥的整體療效并不令人滿意；(2)即使經(jīng)過(guò)藥物治療，真菌被殺滅了，也往往由于炎癥細(xì)胞對(duì)組織的破壞最終仍造成角膜混濁，瘢痕形成。有研究顯示，35.6%～72.3%的患者臨床治愈后遺留下角膜白斑[3-4]，如果白斑在瞳孔部位會(huì)影響視力甚至致盲。另有研究表明，約59.5%的真菌性角膜炎遺留白斑的患者需要進(jìn)行角膜移植[5]，而我國(guó)角膜供體又極其缺乏[6]。鑒于以上現(xiàn)狀，我們的設(shè)想是:在有效抗真菌藥物治療前提下，應(yīng)用非甾體類抗炎藥(non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)雙氯芬酸鈉滴眼液，以期在藥物治療真菌的前提下，減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎癥細(xì)胞對(duì)組織的破壞，從而減輕角膜組織損傷，減輕基質(zhì)混濁和瘢痕形成。本研究以腐皮鐮孢菌性真菌性角膜炎為模型，對(duì)單純抗真菌治療以及局部加用雙氯芬酸鈉治療效果進(jìn)行觀察，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性10～12周齡C57BL/6J小鼠24只，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所。按每籠6只飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃，濕度為59%～61%，每日光照與黑暗時(shí)間各為12 h，由專人管理。動(dòng)物的飼養(yǎng)與使用均遵照視覺(jué)與眼科研究協(xié)會(huì)制定的科研動(dòng)物使用規(guī)范，經(jīng)鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)和河南省眼科研究所生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)管理與倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)用真菌標(biāo)準(zhǔn)菌株腐皮鐮孢菌(編號(hào):3.1791)購(gòu)自北京中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行復(fù)蘇和傳代，生長(zhǎng)良好的真菌用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器1 g·L-1雙氯芬酸鈉滴眼液(河南省眼科研究所院內(nèi)制劑，批號(hào):20120203)；30 g·L-1酮康唑滴眼液(河南省眼科研究所院內(nèi)制劑，批號(hào):20120114)；海德堡視網(wǎng)膜激光斷層掃描系統(tǒng)3代(HRT3)(德國(guó)Heidelberg公司)；SL-8Z型裂隙燈、OMS-90型體視解剖顯微鏡(日本Topcon公司)；免疫熒光顯微鏡(80i)及AR分析軟件(日本Nikon公司)；無(wú)菌碳鋼11號(hào)手術(shù)刀片(上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組將24只小鼠按照體質(zhì)量大小排序，查隨機(jī)數(shù)字表將其隨機(jī)分為手術(shù)對(duì)照組、模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組，每組各6只。手術(shù)對(duì)照組不接種真菌，其余均按照真菌性角膜炎模型的制作方法造模。

1.2.2小鼠真菌性角膜炎模型的建立小鼠腹腔內(nèi)注射80 mg·kg-1戊巴比妥鈉全身麻醉，用10 g·L-1鹽酸丁卡因眼液滴眼進(jìn)行角膜表面麻醉，按照參考文獻(xiàn)[2-3]的方法建立雙眼真菌性角膜炎模型。方法簡(jiǎn)介如下:使用無(wú)菌手術(shù)刀片在角膜中央2 mm環(huán)鉆區(qū)域內(nèi)做十字劃痕，深度至淺基質(zhì)；取與腐皮鐮孢菌共培養(yǎng)3～7 d的帶有腐皮鐮孢菌的竹簽尖端在創(chuàng)面上來(lái)回涂抹腐皮鐮孢菌?；铙w共焦顯微鏡下有菌絲生長(zhǎng)者判定為角膜炎模型制作成功。

1.2.3給藥方式酮康唑組:真菌接種后9 h進(jìn)行模型判定，模型成功者開(kāi)始應(yīng)用酮康唑，1.5 h滴眼1次，共8次，間隔12 h后重復(fù)進(jìn)行，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。雙氯芬酸鈉組:酮康唑給藥方式同酮康唑組，在酮康唑治療基礎(chǔ)上，于真菌接種后33 h給予雙氯芬酸鈉滴眼，每4 h滴眼1次，共3次，間隔12 h后重復(fù)進(jìn)行，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。為保證用藥效果，每次滴眼后保持眼裂睜開(kāi)約1 min，確保藥物進(jìn)入結(jié)膜囊。手術(shù)對(duì)照組和模型組均不給予任何藥物。

1.2.4角膜病變嚴(yán)重程度的裂隙燈觀察各組小鼠于造模成功后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d在裂隙燈下觀察角膜，進(jìn)行角膜病變臨床評(píng)分并拍照，臨床具體評(píng)分規(guī)則參照文獻(xiàn)[7-8]。

1.2.5角膜活體共聚焦顯微鏡檢查各組小鼠于造模成功后1 d、2 d、3 d、4 d、5 d進(jìn)行活體共聚焦顯微鏡檢查。小鼠麻醉后，調(diào)整操縱臺(tái)高度和CCD攝像頭位置，涂Vidisic眼凝膠(美國(guó)博士倫公司生產(chǎn))。雙手持小鼠，使小鼠固定在下頜托上，充分暴露眼球，使小鼠角膜中央?yún)^(qū)域與角膜接觸帽平行，調(diào)整物鏡位置直至激光光束位于小鼠角膜病變區(qū)域。激光波長(zhǎng)為670 nm，觀察以病灶為中心380 μm×380 μm視野范圍，層間掃描深度為5 μm。從角膜內(nèi)皮層開(kāi)始到上皮層結(jié)束，連續(xù)掃描能清晰顯示角膜各層及真菌菌絲浸潤(rùn)的層次，采集圖片并保存。

1.2.6菌絲面積定量和炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)方法挑選從角膜內(nèi)皮層到上皮層所有圖像中有菌絲的圖像，導(dǎo)入到Nikon AR軟件中，手動(dòng)勾畫(huà)每條菌絲邊緣，定量菌絲面積，每個(gè)角膜所有視野菌絲面積之和作為每角膜菌絲面積。手動(dòng)計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞個(gè)數(shù)，每個(gè)角膜所有視野炎癥細(xì)胞之和作為每角膜炎癥細(xì)胞數(shù)。最后以每角膜菌絲面積和炎癥細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.7角膜切片HE病理學(xué)檢查取下造模后5 d手術(shù)對(duì)照組和雙氯芬酸鈉組小鼠的角膜，常規(guī)包埋、切片、HE染色。雙氯芬酸鈉組選取病灶部位切片，手術(shù)對(duì)照組選取劃痕范圍切片，每角膜各選2張切片，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，于40×物鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。每個(gè)細(xì)胞核按一個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，典型的分葉狀細(xì)胞核記作中性粒細(xì)胞，計(jì)算典型的中性粒細(xì)胞和所有基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的比例。

2 結(jié)果

2.1雙氯芬酸鈉對(duì)角膜臨床評(píng)分的影響手術(shù)對(duì)照組1 d時(shí)，角膜中央部位可見(jiàn)極輕微混濁，隨時(shí)間延長(zhǎng)角膜混濁程度減輕、范圍縮小，1 d后恢復(fù)正常(圖1A)。模型組以及各治療組均出現(xiàn)真菌性角膜炎表現(xiàn)，接種24 h后角膜出現(xiàn)毛玻璃樣水腫，隨后病變進(jìn)展迅速，大多出現(xiàn)典型的菌絲苔被，部分可見(jiàn)免疫環(huán)、衛(wèi)星灶。模型組72 h時(shí)病變最為嚴(yán)重，72 h后病變逐漸減輕(圖1B)；酮康唑組用藥后病變范圍得到控制(圖1C)；雙氯芬酸鈉組應(yīng)用雙氯芬酸鈉后，病變范圍逐漸擴(kuò)散，混濁加深，病變加重，有的角膜出現(xiàn)前房積膿(圖1D)。各組不同時(shí)間點(diǎn)角膜臨床評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組與手術(shù)對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)角膜臨床評(píng)分均有顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明造模成功；酮康唑組3 d、4 d和5 d的角膜臨床評(píng)分較模型組顯著降低(均為P<0.01)，說(shuō)明酮康唑治療有效；雙氯芬酸鈉組5 d角膜臨床評(píng)分較模型組升高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明5 d時(shí)雙氯芬酸鈉治療比不治療病變還重。雙氯芬酸鈉組與酮康唑組相比，3 d、4 d和5 d的角膜臨床評(píng)分差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)，說(shuō)明加用雙氯芬酸鈉治療，角膜炎反而加重。

Figure 1 Typical slit lamp pictures of each group.A:Control group;B:Model group;C:Ketoconazole group,decreased after 3 days;D:Diclofenac sodium group 各組典型裂隙燈照片。A:手術(shù)對(duì)照組；B:模型組；C:酮康唑組；D:雙氯芬酸鈉組

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)角膜臨床評(píng)分結(jié)果Table 1 Corneal clinical scores of each group at different time points(±s，Score)

2.2雙氯芬酸鈉對(duì)真菌性角膜炎真菌菌絲的影響各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)活體共焦顯微鏡典型圖片見(jiàn)圖2。手術(shù)對(duì)照組:造模后1 d見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，2 d時(shí)減少，3 d時(shí)基本恢復(fù)正常(圖2A)。模型組:造模后1～2 d基質(zhì)內(nèi)大量菌絲和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；3 d時(shí)菌絲破碎，僅偶見(jiàn)，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；4 d后菌絲消失，炎癥細(xì)胞逐漸減少、消失(圖2B)。酮康唑組:造模后1 d基質(zhì)內(nèi)大量菌絲和炎癥細(xì)胞；2 d時(shí)菌絲變細(xì)，有破碎，炎癥細(xì)胞增多；3 d時(shí)菌絲破碎，僅偶見(jiàn)，炎癥細(xì)胞大量；4 d后菌絲消失，炎癥細(xì)胞逐漸減少、消失(圖2C)。雙氯芬酸鈉組:造模后1～2 d基質(zhì)內(nèi)大量菌絲和炎癥細(xì)胞，3 d時(shí)未找到典型菌絲，炎癥細(xì)胞大量，并且隨時(shí)間延長(zhǎng)而增多(圖2D)。各組不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)真菌菌絲面積見(jiàn)表2。從表2可以看出，造模后1 d，模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組組間真菌菌絲面積相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，造模后2～3 d，酮康唑組和雙氯芬酸鈉組菌絲面積較模型組均有減少趨勢(shì)，但組間相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，可能由于樣本量較少、組間變異較大導(dǎo)致。模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組3 d后角膜內(nèi)菌絲消失，說(shuō)明小鼠的真菌性角膜炎有自愈傾向。雙氯芬酸鈉組與模型組和酮康唑組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明雙氯芬酸鈉對(duì)角膜內(nèi)菌絲無(wú)影響。

Figure 2 Typical in vivo confocal images.A:Control group;B:Model group;C:Ketoconazole group;D:Diclofenac sodium group.Pink arrow indicated inflammatory cells,yellow arrow indicated fungal hyphae 各組典型活體共焦顯微鏡圖片。A:手術(shù)對(duì)照組；B:模型組；C:酮康唑組；D:雙氯芬酸鈉組。粉紅色箭頭所指為炎癥細(xì)胞；黃色箭頭所指為真菌菌絲

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)真菌菌絲面積Table 2 Corneal fungal hyphae area of each group at different time points(±s，S/mm2 pre cornea)

2.3雙氯芬酸鈉對(duì)角膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的影響各組不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況見(jiàn)表3。從表3可以看出，模型組、酮康唑組和雙氯芬酸鈉組與手術(shù)對(duì)照組相比，各時(shí)間點(diǎn)角膜炎癥細(xì)胞數(shù)均有顯著增多(均為P<0.01)，說(shuō)明真菌感染引起的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較無(wú)菌創(chuàng)傷嚴(yán)重；酮康唑組與模型組比較，各時(shí)間點(diǎn)炎癥細(xì)胞數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)，說(shuō)明酮康唑治療對(duì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)無(wú)明顯影響；雙氯芬酸鈉組與模型組和酮康唑組相比，炎癥細(xì)胞數(shù)目 4-5 d均顯著性增多(均為P<0.01)，說(shuō)明加用雙氯芬酸鈉治療，角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多。

2.4雙氯芬酸鈉組角膜臨床評(píng)分和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)關(guān)系對(duì)雙氯芬酸鈉組角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)與角膜臨床評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果顯示，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和角膜病變嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)(r=0.860，P=0.000)。

表3 各組不同時(shí)間點(diǎn)角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況Table 3 Corneal infiltrating cells numbers of each group at different time points(±s，numbers per cornea)

2.5病理學(xué)檢查結(jié)果造模后5 d，手術(shù)對(duì)照組和雙氯芬酸鈉組HE病理學(xué)檢查結(jié)果顯示:手術(shù)對(duì)照組角膜基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞很少，細(xì)胞核形狀提示為基質(zhì)細(xì)胞(圖3A)；而雙氯芬酸鈉組基質(zhì)增厚，基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞增多，多數(shù)為分葉狀中性粒細(xì)胞核型(圖3B)?；|(zhì)內(nèi)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)顯示，可以確認(rèn)的中性粒細(xì)胞占基質(zhì)所有細(xì)胞總數(shù)的72.67%，提示基質(zhì)內(nèi)細(xì)胞以中性粒細(xì)胞為主。

Figure 3 Typical corneal HE staining pictures of fungal infection after 5 days in diclofenac sodium group.A:Control group;B:Diclofenac group.Red arrow indicated typical keratocyte nucleus,yellow arrow indicated typical neutrophil nucleus 造模后5 d角膜典型HE染色病理學(xué)圖片。A:手術(shù)對(duì)照組；B:雙氯芬酸鈉組。紅色箭頭所指為典型的基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞核。黃色箭頭所指為典型的中性粒細(xì)胞細(xì)胞核

3 討論

通過(guò)吞噬細(xì)胞吞噬并殺滅真菌等病原微生物，是生物體最為基本和重要的天然免疫機(jī)制。中性粒細(xì)胞是數(shù)量最多的一種白細(xì)胞，也是真菌性角膜炎中最主要的免疫細(xì)胞，在角膜真菌感染中發(fā)揮著重要作用[7-9]。一般情況下，中性粒細(xì)胞可快速募集至感染部位，吞噬病原微生物后形成吞噬泡，繼而吞噬泡與溶酶體融合，通過(guò)氧化依賴性或非氧化依賴性途徑殺滅病原菌，這種經(jīng)典的中性粒細(xì)胞殺滅病原菌的方式被稱為胞內(nèi)殺滅病原微生物途徑。然而，吞噬了大量病原菌的中性粒細(xì)胞自身最終往往死亡裂解，釋放出大量毒性物質(zhì)和多種生物活性介質(zhì)，在殺滅病原菌的同時(shí)引起化膿性炎癥反應(yīng)和組織壞死[10]。因此，對(duì)真菌感染角膜而言，中性粒細(xì)胞是一把雙刃劍，一方面吞噬、殺滅真菌以控制感染進(jìn)程，另一方面導(dǎo)致強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)和組織損傷。最終的結(jié)局是，雖然真菌被殺滅了，但由于嚴(yán)重的角膜組織破壞，角膜瘢痕形成，最終仍嚴(yán)重影響視力，甚至致盲。

在有效抗真菌治療的前提下，減少中性粒細(xì)胞在角膜感染部位的浸潤(rùn)，從而減輕組織損傷是我們極力想解決的問(wèn)題。臨床上常用的雙氯芬酸鈉是非甾體類抗炎藥的一種，在不引起免疫抑制的情況下，可以抑制COX活性，阻斷花生四烯酸向前列腺素轉(zhuǎn)化，同時(shí)也能促進(jìn)花生四烯酸與甘油三酯結(jié)合，降低細(xì)胞內(nèi)游離的花生四烯酸濃度，間接抑制白三烯的合成，從而發(fā)揮抗炎作用[11]。前期有報(bào)道，真菌性角膜炎早期施行病灶清創(chuàng)加生物羊膜移植和雙氯芬酸鈉治療，對(duì)真菌性角膜炎治愈后角膜瘢痕形成有效[12]。我們研究的初衷是希望能在有效抗真菌藥物治療前提下，聯(lián)合應(yīng)用雙氯芬酸鈉滴眼液，以減輕炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕炎癥細(xì)胞對(duì)組織的破壞，從而減輕角膜組織損傷，減輕基質(zhì)混濁和瘢痕形成。

但是我們的研究結(jié)果與預(yù)期相反:酮康唑加用雙氯芬酸鈉治療，不但不能減輕角膜病變的嚴(yán)重程度，反而增加了真菌性角膜炎的臨床評(píng)分，增加了角膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。此結(jié)果可能與雙氯芬酸鈉的副作用有關(guān)。國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道:正常或穿透性角膜移植術(shù)患者局部應(yīng)用雙氯芬酸鈉滴眼液，可以導(dǎo)致角膜感覺(jué)下降及持續(xù)性角膜上皮缺陷[13-14]。也有文獻(xiàn)認(rèn)為，雙氯芬酸鈉滴眼液引起角膜損傷以及溶解的原因與角膜內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloproteinases，MMP)有關(guān)，雙氯芬酸鈉能誘導(dǎo)角膜表達(dá)MMP-1、MMP-2和 MMP-8，引起角膜損傷和溶解[15]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，雙氯芬酸鈉滴眼液引起角膜內(nèi)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，目前未檢索到類似文獻(xiàn)。最終導(dǎo)致角膜病變加重的原因是否與中性粒細(xì)胞釋放的酶類有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示，真菌性角膜炎小鼠模型在抗真菌治療前提下加用雙氯芬酸鈉治療，不僅不能減輕病情，反而會(huì)加快角膜損傷，使病變加重。此結(jié)果可能與雙氯芬酸鈉副作用有關(guān)。本研究結(jié)果提示，在進(jìn)行真菌性角膜炎治療時(shí)，慎用雙氯芬酸鈉治療。

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date:Mar 13，2014

National Natural Science Foundation of China(No:81170831，81270991)；Henan Provincal Fundamental and Frontier Technological Projects(No:102300410024，112300410036，11230040093，13210-2310087)；Henan Provincal Projects Innovative Talents of Science and Technology(No:144100510019)From theHenanEyeInstitute&HenanEyeHospital，DepartmentofOphthalmology，HenanProvincialPeople’sHospital，People’sHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450003，HenanProvince,China

Influence of diclofenac sodium on therapeutic effects of antifungal drugs for fungal keratitis in mice

ZHANG Hong-Min,LIU Su-Su,LI Jin,LIU Hui,XIE Yan-Ting,WANG Li-Ya

fungal keratitis;diclofenac sodium;ketoconazole;neutrophil;mouse

ObjectiveTo observe the therapeutic effects of antifungal drugs combined with diclofenac sodium on corneal fungal keratitis.MethodsC57BL/6J mice were chosen as experimental animals andFusariumsolanifungal keratitis as a model.Experiment was divided into four groups:control group,fungal keratitis model group,ketoconazole treatment group (ketoconazole therapy alone) and diclofenac sodium treatment group (treated with ketoconazole and diclofenac sodium).Each group was examined with slit lamp microscope andinvivoconfocal scanning microscope at 1 day,2 days,3 days,4 days and 5 days after operation.The severity of corneal disease was evaluated by clinical score with slit lamp microscope.The hypha areas and number of inflammatory cellsinvivoconfocal microscopy images were quantitated.The corneal pathological examination of control group and diclofenac sodium treatment groups were conducted with HE staining at postoperative 5 days.ResultsClinical scores of cornea at each time point in fungal keratitis model group,ketoconazole treatment group and diclofenac sodium treatment group were significantly higher than that in control group (P<0.01).The clinical scores at postoperative 5 days in diclofenac sodium treatment group was significantly higher than that of model group (P<0.001).The clinical scores at postoperative 3 days,4 days and 5 days in diclofenac sodium treatment group were significantly higher than those in ketoconazole treatment groups.The corneal hypha disappeared at postoperative 3 days in model groups and ketoconazole treatment groups.The area of corneal hypha had no significant change in diclofenac sodium treatment group compared with model group and ketoconazole treatment group (P>0.05).The number of corneal inflammatory cells in fungal keratitis model group,ketoconazole treatment group and diclofenac sodium treatment group at each time point were significantly more than that in control group (P<0.01).No significant differences in the number of inflammatory cells were found between ketoconazole treatment group and model group(P>0.05).The number of inflammatory cells in diclofenac sodium treatment group within 4-5 days were significantly more than those in model group and ketoconazole treatment group (P<0.01).The Pearson correlation analysis of corneal inflammatory cells and clinical scores in diclofenac sodium treatment group showed that inflammatory cells infiltration and corneal disease severity was positively correlated (r=0.860,P=0.000).HE staining showed that the cells in corneal stroma in control group were rare,and the cells in corneal stroma increased in diclofenac sodium treatment group.In diclofenac sodium treatment group,the cells in corneal stroma were 72.67% positive neutrophils according to differention count of stromal cells.ConclusionIt should be cautious to use diclofenac sodium in treating fungal keratitis,because the clinical scores,infiltration of corneal inflammatory cells (mainly neutrophils) are significantly increased during antifungal drugs therapy together with topical application of diclofenac sodium in treating fungal keratitis in mice.

張紅敏，女，1969年出生，河南人，博士，副研究員，研究方向?yàn)榻悄づc眼表疾病的基礎(chǔ)研究。聯(lián)系電話:18637107236；E-mail:zhm0906@163.com

AboutZHANGHong-Min:Female，born in 1969.Doctor degree，associate research fellow.Tel:18637107236；E-mail:zhm0906@163.com

2014-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào):81170831、81270991)；河南省基礎(chǔ)與前沿計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):102300410024、112300410036、1123-0040093、132102310087)；河南省科技創(chuàng)新人才計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):144100510019)

450003 河南省鄭州市，河南省立眼科醫(yī)院&河南省眼科研究所，河南省人民醫(yī)院眼科，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院眼科

王麗婭，E-mail:wangliya_55@126.com

張紅敏，劉素素，李金，柳慧，謝艷亭，王麗婭．雙氯芬酸鈉對(duì)小鼠真菌性角膜炎抗真菌療效的影響[J]．眼科新進(jìn)展，2014，34(7)：607?611．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0167

【實(shí)驗(yàn)研究】

修回日期:2014-04-08

本文編輯:盛麗娜

Accepteddate:Apr 8，2014

Responsibleauthor:WANG Li-Ya，E-mail:wangliya_55@126.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):607-611]