陳迎迎 譚少健 梁皓 錢光霞

糖尿病兔后囊膜混濁發(fā)生過程中血清及房水中AGE和IGF-1的變化及去整合素echistatin對二者的影響△

陳迎迎 譚少健 梁皓 錢光霞

后囊膜混濁；糖尿??；晚期糖基化終末產物；胰島素樣生長因子-1；去整合素

目的觀察糖尿病兔后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)發(fā)生過程中血清及房水中晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGE)和胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)的含量變化，同時觀察去整合素echistatin(Ecs)對二者的干預作用。方法將24只兔隨機分為對照組、糖尿病組及Ecs組，后2組應用四氧嘧啶建立糖尿病模型，所有兔行晶狀體摘出術，Ecs組術中晶狀體囊袋內注入10 mg·L-1Ecs，其余2組注入等量高壓滅菌蒸餾水。分別于術后10 d、6周提取3組血清及房水，應用ELISA法檢測AGE和IGF-1含量。結果術后10 d房水中AGE濃度在三組中分別為(0.189±0.200)μg·L-1、(0.467±0.190)μg·L-1、(0.527±0.130)μg·L-1；6周為(0.255±0.640)μg·L-1、(0.716±0.340)μg·L-1、(0.830±0.330)μg·L-1。術后10 d血清中AGE濃度在對照組、糖尿病組和Ecs組中分別為(0.074±0.013)μg·L-1、(0.270±0.120)μg·L-1、(0.213±0.690)μg·L-1；6周為(0.054±0.010)μg·L-1、(0.166±0.460)μg·L-1、(0.149±0.200)μg·L-1。術后10 d房水中IGF-1濃度在3組中分別為(0.279±0.080)μg·L-1、(0.914±0.130)μg·L-1、(0.556±0.290)μg·L-1；6周為(0.176±0.030)μg·L-1、(0.508±0.040)μg·L-1、(0.367±0.090)μg·L-1。術后10 d血清中IGF-1濃度在對照組、糖尿病組和Ecs組中分別為(0.075±0.030)μg·L-1、(0.293±0.160)μg·L-1、(0.305±0.160)μg·L-1；6周為(0.032±0.020)μg·L-1、(0.833±0.570)μg·L-1、(0.788±0.530)μg·L-1。術后10 d及6周對照組血清及房水中AGE和IGF-1含量均低于糖尿病組及Ecs組(均為P<0.05)。糖尿病組及Ecs組中AGE含量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，糖尿病組及Ecs組中IGF-1含量在血清中差異均無統(tǒng)計學意義(均為P>0.05)，但在房水中Ecs組IGF-1含量明顯低于糖尿病組(P=0.003、0.031)。結論AGE和IGF-1可能促進了糖尿病兔PCO的發(fā)生和發(fā)展，降低房水中IGF-1的含量可能是去整合素Ecs抑制PCO發(fā)展的機制之一。

[眼科新進展，2014，34(7):612-615]

已有研究報道糖尿病性白內障術后有更高的后發(fā)性白內障發(fā)生率[1-3]，后發(fā)性白內障主要表現為后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)。血糖濃度升高[4]，術后殘留的晶狀體上皮細胞(lens epithelium cells，LEC)出現多種整合素的高表達等因素都有促使LEC異常增殖、黏附和分化的作用，從而促進了PCO的發(fā)生發(fā)展[5]。近年研究發(fā)現LEC的過度增殖及異常分化也與房水內眾多的細胞因子含量改變有關。為觀察糖尿病并發(fā)癥相關因子與PCO的關系，本文通過測定糖尿病兔PCO模型血清及房水中晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGE)和胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)含量，旨在探討房水中這2種因子與糖尿病條件下PCO發(fā)生發(fā)展的相關性，并應用去整合素echistatin(Ecs)進行干預，觀察其對AGE和IGF-1含量的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物新西蘭大白兔24只(購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心)，雌雄不限，體質量2.4～2.8 kg，眼部檢查無異常。由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。本實驗動物的飼養(yǎng)與使用均遵循視覺與眼科學研究學會(ARVO)關于動物使用原則的規(guī)定，并且經廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會批準。

1.2試劑與儀器去整合素Ecs(Sigma公司)，四氧嘧啶(Sigma公司)，ONE TOUCH血糖分析儀(美國強生)，血糖試紙條(美國強生，穩(wěn)豪型)，長效胰島素注射液(甘精胰島素注射液，Sanofi-Aventis Deutschland GmbH，德國)，兔AGE酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(上海藍基)、兔IGF-1 ELISA試劑盒(武漢華美)，Multiskan MK3酶標儀(美國Thermo Scientific)。

1.3方法

1.3.1糖尿病兔模型的建立在24只新西蘭大白兔中隨機選擇16只用四氧嘧啶按100 mg·kg-1耳緣靜脈注射建立糖尿病兔模型，當血糖持續(xù)2周大于12 mmol·L-1時，為建模成功。對于血糖濃度高于16 mmol·L-1者，根據血糖值給予皮下注射長效胰島素，使其血糖控制在12～16 mmol·L-1之間。其余8只兔子同期行左耳緣靜脈注射等量高壓滅菌蒸餾水，并同期測血糖。

1.3.2糖尿病兔PCO模型的建立和分組8只未建模且血糖正常兔設為對照組。16只建模成功的糖尿病兔16眼(右眼)隨機分為糖尿病組和Ecs組，每組8只兔8眼。每只兔右眼由同一術者行透明晶狀體囊外摘出術。術畢Ecs組晶狀體囊袋內注入10 mg·L-1Ecs溶液0.2 mL，對照組和糖尿病組注入高壓滅菌蒸餾水0.2 mL。術畢結膜下注射慶大霉素地塞米松注射液，術后用慶大霉素地塞米松眼液和阿托品眼液滴術眼7～10 d，每天4次。夜間涂四環(huán)素可的松眼膏，直至角膜水腫、前房滲出消失。

1.3.3酶聯(lián)免疫吸附測定方法

1.3.3.1標本采集分別于術后10 d、6周隨機抽取各組動物各4只，抽耳緣靜脈血并提取血清 -80 ℃ 保存。并于耳緣靜脈采血后空氣栓塞法處死動物，處死后立即經角鞏膜緣處以5號針頭行前房穿刺，分別抽取房水0.1～0.2 mL，于-80 ℃保存。

1.3.3.2方法測定前從4 ℃冰箱取出AGE或IGF-1 ELISA試劑盒，開啟前室溫平衡30 min。取出房水或血清，室溫融化，備用。嚴格按照說明書操作。終止反應后，測定在加入終止液后5 min內進行，在酶標儀上讀取AGE波長450 nm和630 nm處的吸光度(A)值，IGF-1波長450 nm和570 nm處的吸光度(A)值，AGE OD值=A450-A630，IGF-1 OD值=A450-A570。根據標準濃度及對應的OD值計算出標準曲線的回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

2 結果

2.1房水中AGE與IGF-1的濃度3組兔房水中AGE和IGF-1的濃度見表1，由表1可見:對照組房水中AGE的含量在術后10 d、6周時均低于糖尿病組(P=0.016、0.041)和Ecs組(P=0.006、0.015)，但糖尿病組和Ecs組房水中AGE的含量差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.905、0.567)；對照組房水中IGF-1的含量在術后10 d、6周時亦均低于糖尿病組(P<0.000、=0.001)和Ecs組(P=0.011、0.009)，Ecs組房水中IGF-1含量在各時間點均低于糖尿病組(P=0.003、0.031)。

表1 3組兔房水中AGE與IGF-1濃度的比較Table 1 AGE and IGF-1 concentrations in aqueous humor of three groups(±s，ρ/μg·L-1)

2.2血清中AGE與IGF-1的濃度3組兔血清中AGE和IGF的濃度見表2，由表2可見:對照組血清中AGE的含量在術后10 d、6周時均低于糖尿病組(P=0.008、<0.000)和Ecs組(P=0.039、0.001)，糖尿病組和Ecs組血清中AGE的含量差異無統(tǒng)計學意義(P=0.352、0.430)；對照組血清中IGF-1的含量在術后10 d、6周時亦均低于糖尿病組(P=0.044、0.032)和Ecs組(P=0.036、0.040)，糖尿病組和Ecs組的IGF-1含量差異均無統(tǒng)計學意義(P=0.905、0.891)。

表2 3組兔血清中AGE與IGF-1濃度的比較Table 2 AGE and IGF-1 concentrations in serum of three groups(±s，ρ/μg·L-1)

3 討論

我們的前期研究表明糖尿病兔較正常血糖兔更早出現PCO[6]，同時發(fā)現使用去整合素Ecs可有效降低糖尿病兔PCO分級，抑制PCO的發(fā)展。糖尿病并發(fā)癥相關的致病因子是否促進了糖尿病PCO的發(fā)展、去整合素Ecs是否通過對上述因子的調控從而發(fā)揮抑制PCO的作用尚未見相關文獻報道。

AGE是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素。目前，AGE在眼部的致病作用日益受到重視[7]。AGE指還原糖如葡萄糖的醛基或酮基與蛋白質、脂質或核酸的氨基發(fā)生非酶糖化反應，最終生成不可逆的高級糖化終產物，并且由于受血糖濃度的影響，形成后不易降解，可在糖尿病患者個體中積聚，表現出致病作用。高血糖、炎性反應等因素可促進AGE的形成[8]。房水中的AGE以及眼組織中的長壽蛋白糖化形成的AGE與其受體相互作用，導致糖尿病相關的角膜、白內障、視網膜等病變[7]。本研究表明糖尿病兔行晶狀體摘出術后，其血清及房水中AGE含量均高于非糖尿病兔。這與Lu等[4]的體外實驗結果一致，該實驗發(fā)現高糖條件下培養(yǎng)的LEC中AGE水平提高，提示AGE可能參與了糖尿病相關的白內障的發(fā)生和發(fā)展。在活體內，糖尿病循環(huán)血中高含量的AGE沉積在眼部以及術后炎性反應刺激均造成糖尿病兔房水中AGE含量的增高。Hong等[9]報道AGE可促進LEC纖維化改變，使纖連蛋白、Ⅰ型膠原、肌纖維母細胞及異常細胞外基質的合成增加。羅怡等[10]報道AGE可誘導體外培養(yǎng)的LEC中轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)上調，而TGF-β是促進LEC發(fā)生間質轉分化的最重要因子之一[5]。因此糖尿病兔晶狀體摘出術后在房水中大量堆積的AGE可能通過上調TGF-β的表達發(fā)揮了促LEC間質轉分化的作用，從而促進PCO的發(fā)生和發(fā)展。

有研究表明AGE與整合素存在關聯(lián):在糖尿病腎病研究中發(fā)現AGE通過β1整合素及其下游分子FAK途徑誘導細胞外基質表達增加，促進細胞黏附、增殖。AGE也可通過趨化與活化單核巨噬細胞等細胞增加細胞因子的分泌和釋放，包括TGF-β、血小板衍性生長因子等可上調β1整合素及FAK的表達[11]。但在本實驗中并未觀察到β1整合素的特異性拮抗劑—去整合素Ecs的干預對AGE造成明顯的影響，其含量與單純糖尿病組的差異并無統(tǒng)計學意義。有可能是AGE與整合素是單向調節(jié)的關系，即AGE可調控整合素的表達，但整合素對AGE并無反饋調節(jié)作用。我們的前期實驗表明去整合素Ecs既可有效抑制體外培養(yǎng)的LEC增殖、遷移、黏附[3]，也可有效降低糖尿病兔PCO的分級[12]。結合Ecs對AGE的實驗結果可以推測Ecs上述抑制PCO的作用可能并非通過影響AGE而實現的。

IGF-1是一類具有胰島素類似結構和生理功能的多肽，既有促細胞分化和增殖功能，同時又是細胞凋亡的一個重要抑制因子。在晶狀體研究中發(fā)現糖尿病白內障患者房水中IGF-1含量高于非糖尿病患者，其參與了糖尿病性白內障的形成。本研究證實糖尿病兔在晶狀體摘出術后其血清及房水中的IGF-1含量高于非糖尿病兔。其原因可能是手術損傷導致IGF-1表達上升，使前房局部內源性的IGF-1分泌增加；同時高糖使晶狀體內環(huán)境代謝失衡，導致血-房水屏障的破壞[13]，使血清中進入房水的外源性IGF-1也增加。由于房水中的IGF-1可促進LEC的增殖，減少LEC的凋亡[14-16]，而且IGF-1與LEC上的IGF-1受體結合后可觸發(fā)caspase-3介導的LEC轉分化過程[17-18]，因此糖尿病兔晶狀體摘出術后房水中含量增高的IGF-1可能加強了其在眼內的促LEC增殖、分化及抗凋亡的作用，從而促進了PCO的發(fā)生和發(fā)展。

有實驗表明IGF-1在促進細胞黏附、增殖、分化中所起的作用是通過生物信號轉導，激活了PI3K和MARK兩條途徑，而這也包括了整合素的參與。Lynch等[19]研究發(fā)現由IGF-1受體介導乳腺癌細胞的黏附和轉移是通過β1亞單位的整合素發(fā)揮作用的。Fujita等[20]研究表明整合素αvβ3與IGF-1及其受體結合形成αvβ3-IGF1-IGF1R三復合體是激活IGF-1信號通路的必要條件。在本實驗中，在糖尿病兔晶狀體摘出術后的眼前房注入去整合素Ecs雖然沒有引起血清中IGF-1含量的明顯變化，但影響了房水中IGF-1的表達，無論是術后10 d還是6周，Ecs組房水中IGF-1的含量均低于糖尿病組。提示Ecs影響PCO的發(fā)生發(fā)展可能與降低IGF-1的表達相關。

綜上所述，本實驗表明糖尿病兔晶狀體摘出術后血清和房水中AGE和IGF-1含量均高于正常血糖兔，提示二者可能對糖尿病更早出現的PCO發(fā)揮了一定的促進作用。術中囊袋內注入去整合素Ecs可有效抑制房水中IGF-1的表達，這可能與Ecs抑制PCO的發(fā)生和發(fā)展的機制有關。本實驗初步探討了糖尿病活體模型中可能參與PCO發(fā)展的糖尿病相關因素以及去整合素Ecs防治糖尿病性PCO的機制，為進一步明確糖尿病條件下PCO發(fā)生發(fā)展機制以及疾病防治的深入研究提供了一定的實驗基礎。

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date:Mar 20，2014

National Natural Science Foundation of China(No:81160120)From theDepartmentofOphthalmology，theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，GuangxiZhuangAutonomousRegion，China

Levels of AGE and IGF-1 in serum and aqueous humor of posterior capsular opacification models in diabetic rabbits and effects of disintegrin echistatin on them

CHEN Ying-Ying,TAN Shao-Jian,LIANG Hao,QIAN Guang-Xia

posterior capsular opacification;diabetes;advanced glycation end products;insulin-like growth actor-1;disintegrin

ObjectiveTo investigate the levels of advanced glycation end products (AGE) and insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in serum and aqueous humor of posterior capsular opacification in diabetic rabbits,and observe the effects of disintegrate echistatin (Ecs) on them.MethodsTwenty-four New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups:control group，diabetic group and Ecs group.The rabbits of diabetic group and Ecs group were treated with ear vein injection of alloxan.The rabbits of control group were given the same volume of sterilization distilled water.After the model constructed,all the rabbits were implemented lens extraction surgery.During the surgery,the rabbits of control group and diabetic group were injected with sterilization distilled water into lens capsular bags and the Ecs group was injected with 10 mg·L-1Ecs.The serum and aqueous humor of rabbits were extracted at 10 days and 6 weeks after surgery,and the levels of AGE and IGF-1 were determined using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique.ResultsTen days after surgery,AGE concentration in serum of the control group,diabetes group and Ecs group were (0.074±0.013) μg·L-1,(0.270±0.120) μg·L-1,(0.213±0.690) μg·L-1,respectively,which at 6 weeks after surgery were (0.054±0.010) μg·L-1,(0.166±0.460) μg·L-1,(0.149±0.200) μg·L-1,respectively.Ten days after surgery,AGE concentration in aqueous humor of the control group,diabetes group and Ecs group respectively were (0.189±0.200) μg·L-1,(0.467±0.190) μg·L-1,(0.527±0.130) μg·L-1,respectively,which at 6 weeks after surgery were (0.255±0.640) μg·L-1,(0.716±0.340) μg·L-1,(0.830±0.330) μg·L-1,respectively.Ten days after surgery,IGF-1 concentration in serum of the control group,diabetes group and Ecs group respectively were (0.075±0.030) μg·L-1,(0.293±0.160) μg·L-1,(0.305±0.160) μg·L-1,respectively,which at 6 weeks after surgery were (0.032±0.020) μg·L-1,(0.833±0.570) μg·L-1,(0.788±0.530) μg·L-1,respectively.Ten days after surgery,IGF-1 concentration in aqueous humor of the control group,diabetes group and Ecs group respectively were (0.279±0.080) μg·L-1,(0.914±0.130) μg·L-1,(0.556±0.29) μg·L-1,respectively,which at 6 weeks after surgery were (0.176±0.030) μg·L-1,(0.508±0.040) μg·L-1,(0.367±0.090) μg·L-1,respectively.The levels of AGE and IGF-1 in serum and aqueous humor of rabbits in control group at 10 days or 6 weeks after surgery were lower than those in diabetic group and Ecs group(allP<0.05).There was no difference in AGE levels in serum or aqueous humor between diabetic group and Ecs group (allP>0.05).The IGF-1 levels in aqueous humor in Ecs group was lower than those in diabetic group (P=0.003,0.031),but there was no difference in serum between two groups (allP>0.05).ConclusionAGE and IGF-1 may promote the occurrence and development of posterior capsular opacification in diabetic rabbits,and lower IGF-1 levels in the aqueous humor may be one of the mechanisms that disintegrin Ecs inhibiting the development of posterior capsular opacification in diabetic rabbits.

陳迎迎，女，1978年10月出生，廣西橫縣人，在讀博士研究生，副主任醫(yī)師。主要研究方向為晶狀體疾病。聯(lián)系電話:0771-5356507(O)；E-mail:chenyingying_cyy@163.com

AboutCHENYing-Ying:Female，born in October，1978.Doctoral candidate，associate chief physician.Tel:+86-771-5356507(O)；E-mail:chenyingying_cyy @ 163.com

2014-03-20

國家自然科學基金項目(編號:81160120)

530021 廣西南寧市，廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院眼科

譚少健，E-mail:shaojiantan@163.com

陳迎迎，譚少健，梁皓，錢光霞．糖尿病兔后囊膜混濁發(fā)生過程中血清及房水中AGE和IGF?1的變化及去整合素echistatin對二者的影響[J]．眼科新進展，2014，34(7)：612?615．

10．13389/j．cnki．rao．2014．0168

【實驗研究】

修回日期:2014-04-21

本文編輯:方紅玲

Accepteddate:Apr 21，2014

Responsibleauthor:TAN Shao-Jian，E-mail:shaojiantan@163.com

[RecAdvOphthalmol，2014，34(7):612-615]