何曉丹，趙瑩，趙麗亞，肖君華，周宇荀，李凱

(1.東華大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)研究所，上海 2016203;2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203)

在哺乳動(dòng)物毛囊細(xì)胞中，α-促黑色素細(xì)胞激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)與黑色素細(xì)胞膜上的黑素皮質(zhì)素受體1(melanocortin-1 receptor，MC1R)結(jié)合，能激活膜上的腺苷酸環(huán)化酶系統(tǒng)，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)腺苷酸的升高，從而激活酪氨酸酶，催化黑色素細(xì)胞從血液中攝取的酪氨酸經(jīng)高爾基復(fù)合體變成多巴及多巴醌，最后合成皮膚黑色素的主要成分—真黑素［1-5］。Agouti基因編碼的Agouti信號(hào)蛋白(Agouti signaling protein，ASP)對(duì)α-促黑色素細(xì)胞激素(α-MSH)和黑素皮質(zhì)素受體MC1R的結(jié)合起到拮抗作用，從而使毛囊黑色素細(xì)胞合成褐黑素而不是真黑素［6］。

Agouti信號(hào)蛋白表達(dá)量的高低或者與受體結(jié)合能力的改變，會(huì)影響毛囊黑色素細(xì)胞合成真黑素或褐黑素能力［7-9］。Bultman 等［10］研究表明隱性等位基因a(non-agouti)是由于Agouti基因的第一個(gè)內(nèi)含子中插入了一個(gè)11 kb的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，使Agouti基因發(fā)生了功能喪失性突變。最典型的例子是C57BL/6J小鼠，該品系具有a/a基因型，不能正常表達(dá)Agouti信號(hào)蛋白，從而使褐黑素水平降低，真黑素升高，其皮毛呈現(xiàn)純黑色。文獻(xiàn)報(bào)道，可活黃Avy小鼠胚胎發(fā)育早期IAP啟動(dòng)子上CpG島不同程度的甲基化會(huì)影響Agouti信號(hào)蛋白的表達(dá)，甲基化程度升高，后代小鼠毛發(fā)顏色也隨之變深;反之，則變淺［11-14］。

本實(shí)驗(yàn)室在小鼠染色體工程研究［15］中，采集國(guó)內(nèi)25個(gè)不同區(qū)域的野生小鼠作為供體，將C57BL/6J作為受體，選定1號(hào)染色體，采用連續(xù)回交的方法進(jìn)行染色體替換，形成“特異染色體替換小鼠群體”。在該群體中，每個(gè)個(gè)體的1號(hào)染色體來(lái)源不同，其余染色體完全一致，都來(lái)源于C57BL/6J品系。利用SNP芯片，對(duì)“野生來(lái)源小鼠1號(hào)染色體替換系”進(jìn)行全基因組掃描后，發(fā)現(xiàn)2號(hào)染色體上有一個(gè)與小鼠毛色緊密連鎖的區(qū)段:rs13476817-rs13476889，其中存在一個(gè)與野生毛色相關(guān)的候選基因Agouti。為此利用生物信息學(xué)方法對(duì)Agouti基因及其編碼產(chǎn)物的理化性質(zhì)、序列特征、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，旨在分子水平理解Agouti基因編碼序列的突變對(duì)毛色的影響，以期為進(jìn)一步研究小鼠毛色的遺傳規(guī)律提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)與樣本采集

在構(gòu)建野生小鼠1號(hào)染色體替換群體的過(guò)程中，人工篩選保留毛色深淺差異明顯的8個(gè)灰色小鼠品系作為實(shí)驗(yàn)樣本(回交7次后代)，其供體分別源自崇明、泰州、嘉興、南匯、雉城、臨沂、棗莊、金山，對(duì)應(yīng)圖1中的1-4號(hào)和6-9號(hào)樣本。C3H/He(購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源中心西普爾-必凱公司)小鼠毛色為灰色，作為參照樣本，對(duì)應(yīng)圖1中的5號(hào)樣本。小鼠的飼養(yǎng)繁殖實(shí)驗(yàn)在東華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施內(nèi)［SYXK(滬)2008-0059］進(jìn)行。

取不同品系和C3H/He的成年小鼠背部皮膚，用清水洗凈，烘干，利用電腦測(cè)色配色儀Datacolor 650測(cè)其K/S，K表示被測(cè)物體的吸收系數(shù)，S表示散射系數(shù)。根據(jù)Kubelka-Munk染色深度方程計(jì)算固體試樣中的有色物質(zhì)濃度，K/S值越大，有色物質(zhì)濃度越高，即固體試樣表面顏色越深。

1.2 DNA提取及芯片分析

DNA提取采用Axygen基因組DNA抽提試劑盒，操作步驟依說(shuō)明書進(jìn)行。以0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000c超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific，美國(guó))確定DNA質(zhì)量和濃度。SNP芯片采用 Mouse MD linkage(Illumina，美國(guó))，由晶能生物技術(shù)(上海)有限公司完成。

1.3 RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄PCR

Trizol法抽提5日齡的小鼠皮膚組織樣本總RNA，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。提取的總RNA用DEPC處理水充分溶解，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，操作參照說(shuō)明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.5 μL，上下游引物(2 μmol/L)各 1.25 μL，Taq 酶 1.5 U 和 cDNA 模板30 ng，DEPC處理水補(bǔ)足。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性2 min;95℃變性30 s，61℃退火90 s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min后冷卻至4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對(duì)全基因組SNP芯片掃描數(shù)據(jù)進(jìn)行單倍型分析，卡方檢驗(yàn)單倍型與理論值的差異。采用Chromas軟件分析測(cè)序序列，并用DNAMAN軟件將測(cè)序所得序列與NCBI上的其他哺乳動(dòng)物序列進(jìn)行相似性比較。由 PROVEAN［16］(http://provean.jcvi.org/index.php)預(yù)測(cè)氨基酸替換對(duì)蛋白質(zhì)生物功能的影響。使用 PDBsum Generate(http://www.ebi.ac.uk/thorntonsrv/databases/pdbsum/Generate.html)進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和比對(duì)，以及Swiss-Model(http://swissmodel.expasy.org/)和Swiss-PdbView軟件分別預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)以及其與受體的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠毛色表型差異

根據(jù)直接觀察，8個(gè)品系小鼠間存在明顯色差(圖1A)，利用電腦測(cè)色配色儀檢測(cè)這幾個(gè)品系和C3H/He小鼠毛色(圖1B)，C3H/He小鼠的K/S值為13.44，8個(gè)品系的K/S值分別居于其兩側(cè)。按C3H/He小鼠的K/S值為界劃分，可將這8種品系的小鼠劃分為淺灰和深灰兩種類型。

圖1 不同品系灰色小鼠皮毛(A)與色深(B)Fig.1 Different skin fur(A)and shades(B)of different gray mice

2.2 全基因組掃描與候選基因定位

對(duì)N7代小鼠進(jìn)行SNP array芯片全掃，共掃描1449個(gè)位點(diǎn)。掃描結(jié)果顯示(表1)，在野生小鼠連續(xù)回交七代后，部分染色體上仍存在少量的雜合子。比較黑色小鼠和灰色小鼠的雜合度與理論值的差異，發(fā)現(xiàn)2號(hào)染色體(P＜0.01)明顯偏離理論值，達(dá)極顯著差異;而其他染色體上的P值皆大于0.2，表明與理論值相接近，差異無(wú)顯著性。

對(duì)其進(jìn)行單倍型分析，結(jié)果如圖2所示，將毛色相關(guān)基因定位到2號(hào)染色體上的rs13476817和rs13476889之間。上述兩個(gè) SNP遺傳距離在60.37cM和97.89cM之間，候選區(qū)段內(nèi)只有Agouti基因與小鼠毛色相關(guān)，因此選定該基因?yàn)楹蜻x基因。

2.3 測(cè)序及氨基酸對(duì)比結(jié)果

2.3.1 候選基因的cDNA序列多態(tài)性

候選基因cDNA測(cè)序結(jié)果表明Agouti基因開(kāi)放讀碼框(ORF)長(zhǎng)396 bp，編碼的Agouti信號(hào)蛋白具有131個(gè)氨基酸(圖3A)。與NCBI參考序列比對(duì)，確定C3H/He小鼠的Agouti基因序列無(wú)任何變化，因此定義為野生型。

8個(gè)品系加上C3H/He小鼠的多序列比對(duì)結(jié)果顯示，淺灰鼠或深灰鼠在其編碼框的第37 bp處都具有A→G突變;淺灰鼠在108 bp和110 bp處發(fā)生G→A突變，以及在309 bp處發(fā)生A→G突變;深灰鼠在286 bp處發(fā)生C→G突變。在這5個(gè)發(fā)生突變的位點(diǎn)中，其中有4個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基轉(zhuǎn)換，1個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基顛換。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，將淺灰鼠發(fā)生的突變類型定義為Ⅰ類突變型，有三個(gè)堿基轉(zhuǎn)換;深灰鼠發(fā)生的突變類型定義為Ⅱ類突變型，有一個(gè)堿基轉(zhuǎn)換和一個(gè)堿基顛換。

表1 全基因組掃描結(jié)果Tab.1 The results of genome-wide scan

圖2 單倍型分析結(jié)果Fig.2 The results of haplotype analysis

2.3.2 氨基酸序列多態(tài)性

氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明(圖3B)，兩類突變型在第108位和309位的堿基被替換后所編碼的氨基酸保持不變，產(chǎn)生同義突變;第37位的突變發(fā)生在信號(hào)肽上，導(dǎo)致絲氨酸突變?yōu)楦拾彼帷＂耦愅蛔冃偷?10位的突變發(fā)生在功能區(qū)的N端，導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?。Ⅱ類突變型?86位的突變發(fā)生在富含半胱氨酸的C末端，導(dǎo)致精氨酸突變?yōu)楦拾彼?。分別將這三處突變進(jìn)一步分析。

利用Signal P 4.1 Server軟件分析Ⅰ類突變型和Ⅱ類突變型的Agouti信號(hào)蛋白，表明信號(hào)肽上的突變沒(méi)有影響蛋白質(zhì)的功能，其信號(hào)肽的長(zhǎng)度、剪切位點(diǎn)仍與野生型的一致。

為增加檢測(cè)的靈敏度，利用PROVEAN預(yù)測(cè)單一氨基酸替換對(duì)Agouti信號(hào)蛋白質(zhì)功能區(qū)的影響，設(shè)定閾值為-1.3，其準(zhǔn)確度(balanced acurracy)達(dá)到76.1%。此時(shí)發(fā)現(xiàn)Ⅰ類突變型功能區(qū)的R37Q的得分為-0.103，大于-1.3，說(shuō)明該突變對(duì)Agouti信號(hào)蛋白的功能無(wú)明顯影響;而Ⅱ類突變型C末端的R96G的得分為-1.344，小于-1.3，則該突變可能影響Agouti信號(hào)蛋白的功能。

2.3.3 序列保守性

哺乳動(dòng)物間Agouti信號(hào)蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果顯示(如圖4)，Agouti信號(hào)蛋白在不同物種間相似性較高，小鼠和人類、牛、馬、兔、羊等的相似性分別為79%、77%、77%、81%、76%。在不同物種間，第13位和第37位的氨基酸則都存在不同程度的多態(tài)性。該分析還表明，C末端的半胱氨酸富含區(qū)具有高度的保守性，其中第101位(即小鼠Agouti基因氨基酸序列的第96位)的氨基酸均為精氨酸(R)，在不同物種間極為保守，因此Ⅱ類突變型C末端的R96G有可能影響蛋白質(zhì)性質(zhì)與功能。

圖3 Agouti基因cDNA序列多態(tài)性(A)和氨基酸(B)序列多態(tài)性Fig.3 The polymorphisms of Agouti cDNA sequence(A)and amino acid sequence(B)

2.4 ASP信號(hào)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.4.1 氨基酸改變對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

分別對(duì)野生型、Ⅰ類突變型和Ⅱ類突變型的Agouti信號(hào)蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，如圖5A所示。結(jié)果表明Ⅰ類突變型和野生型的二級(jí)結(jié)構(gòu)一致，Ⅱ類突變型的Agouti信號(hào)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的C末端比野生型多了一個(gè)γ轉(zhuǎn)角和一個(gè)二硫鍵，但少了一個(gè)β轉(zhuǎn)角，該β轉(zhuǎn)角的缺失導(dǎo)致Ⅱ類突變體上其余的β轉(zhuǎn)角相較于野生型都發(fā)生了不同程度的變化(圖5B)，這些突變可能會(huì)改變Agouti信號(hào)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2.4.2 預(yù)測(cè)Agouti信號(hào)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與受體的結(jié)合

預(yù)測(cè)Agouti信號(hào)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)發(fā)現(xiàn)，相較于野生型，Ⅰ類突變型未發(fā)生任何變化，Ⅱ類突變型Agouti信號(hào)蛋白的C末端缺失一個(gè)β折疊(如圖6所示箭頭)，導(dǎo)致Agouti信號(hào)蛋白的正確折疊受到影響，這一結(jié)果符合Agouti信號(hào)蛋白的C末端(92-131AA)高度保守［17］的特性。

在模擬Agouti信號(hào)蛋白與黑素皮質(zhì)素受體MC1R的結(jié)合(圖7)時(shí)發(fā)現(xiàn)，Ⅱ類突變型的空間結(jié)構(gòu)由緊密型變?yōu)槭枭⑿汀娜S結(jié)構(gòu)模擬圖中可以看出，野生型Agouti信號(hào)蛋白與受體MC1R結(jié)合的殘基為116位精氨酸(Arg)、117位苯丙氨酸(Phe)和118位的苯丙氨酸(Phe)，配體與受體結(jié)合緊密。但是突變后的Agouti信號(hào)蛋白與受體結(jié)合的殘基僅剩117位的苯丙氨酸(Phe)，與受體的結(jié)合明顯松散。

3 討論

本研究在深灰色與淺灰色小鼠這兩組小鼠中，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)SNPs，產(chǎn)生3個(gè)氨基酸突變，其中兩個(gè)無(wú)明顯影響，第三個(gè)突變改變了Agouti信號(hào)蛋白的正確折疊，進(jìn)而影響了Agouti信號(hào)蛋白的結(jié)構(gòu)與功能。

圖4 12種哺乳動(dòng)物Agouti基因在氨基酸組成上的比較分析Fig.4 Comparative analysis of amino acid composition of Agouti gene in twelve mammals

從物種間的保守性角度來(lái)分析，Agouti基因在C末端非常保守，尤其是92～131氨基酸，而本研究的C末端R96G恰好位于該區(qū)域，該位點(diǎn)在物種間相似性程度達(dá)100%，推測(cè)該區(qū)域內(nèi)的突變會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)功能的改變。

Willard等［18］用酶對(duì)Agouti信號(hào)蛋白進(jìn)行消化后發(fā)現(xiàn)，C末端(保留81～131氨基酸殘基的蛋白片段)仍具有完整的Agouti信號(hào)蛋白生物活性;研究Agouti基因的突變發(fā)現(xiàn)，Agouti信號(hào)蛋白(ASP)的N端糖基化位點(diǎn)和主要富含半胱氨酸區(qū)的C末端對(duì)保留ASP完整的生物學(xué)功能十分重要，而富含賴氨酸/精氨酸殘基的中間區(qū)的基因突變似乎不影響ASP的生物學(xué)功能［19-20］。本研究證實(shí)，Ⅰ類突變型Agouti編碼區(qū)的突變沒(méi)有發(fā)生在N端連接的糖基化位點(diǎn)和C末端，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能沒(méi)有任何影響。Ⅱ類突變型的Agouti編碼區(qū)的突變不僅發(fā)生在Agouti信號(hào)蛋白的C末端，而且還發(fā)生在KxxxxKxxR這個(gè)重要的模序［21］中。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Agouti信號(hào)蛋白C末端第83位Val→Ala的突變會(huì)降低抑制 α-MSH結(jié)合到受體MC1R的能力［23］。這與本研究發(fā)現(xiàn)Agouti信號(hào)蛋白C末端R96G會(huì)降低ASP與MC1R結(jié)合效價(jià)的結(jié)果相一致。進(jìn)一步利用生物信息學(xué)分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，該突變使Ⅱ類突變型Agouti信號(hào)蛋白在突變位點(diǎn)比野生型缺少了一個(gè)β折疊，導(dǎo)致其構(gòu)象不如野生型緊密;同時(shí)其與受體MC1R的結(jié)合位點(diǎn)僅剩117位的苯丙氨酸，而不是殘基三聯(lián)體(Arg-Phe-Phe，RFF)［21-22］，導(dǎo)致與受體的結(jié)合能力有所下降。利用電腦測(cè)色配色儀對(duì)不同品系間存在毛色差異的小鼠進(jìn)行毛色檢測(cè)(圖1)，發(fā)現(xiàn)Ⅱ類突變型小鼠的毛色相較于野生型和Ⅰ類突變型小鼠偏向于較深的灰色。

圖5 Agouti信號(hào)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of the secondary structure of Agouti signaling protein

圖6 Agouti信號(hào)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of the tertiary structure of Agouti signaling protein

圖7 Agouti信號(hào)蛋白與受體MC1R的結(jié)合Fig.7 Agouti signaling protein binding to MC1R

綜上所述，本研究在候選基因Agouti編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)的突變(R96G)為重要錯(cuò)義突變，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該突變降低了Agouti信號(hào)蛋白抑制α-MSH結(jié)合到受體MC1R的能力，使毛囊黑色素細(xì)胞主要合成真黑素而不是褐黑素，導(dǎo)致真黑素/褐黑素的比例升高，影響毛色的表型。

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