戴方偉，宋曉明，盧領(lǐng)群，周莎桑，薩曉嬰，呂宇，應(yīng)華忠

(1浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310013;2杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，杭州 310036)

漢坦病毒(Hantavirus，HV)屬布尼亞病毒科，是一種有包膜分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，包括引起漢坦病毒腎綜合征出血熱(HFRS)的漢坦型、漢城型、普馬拉型等，以及引起漢坦病毒肺綜合征(HPS)的紐約型、無(wú)名型等，在我國(guó)以漢坦型和漢城型為主要流行株［1］。自然宿主以小型嚙齒動(dòng)物為主，并經(jīng)由嚙齒類(lèi)動(dòng)物傳染給人類(lèi)，引起HFRS或HPS等［2］，因此從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)及科學(xué)研究人員存在接觸攜帶HV的宿主動(dòng)物及其排泄物、污染的塵埃等而被感染的風(fēng)險(xiǎn)。由于HV引發(fā)疾病的類(lèi)型及其嚴(yán)重程度取決于病毒的型別，對(duì)漢坦病毒株的分型，以及闡明病毒之間的關(guān)系對(duì)HV病原防治具有重要的意義［3-4］。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物漢坦病毒的檢測(cè)有血清檢測(cè)和基因檢測(cè)兩種，目前血清檢測(cè)是漢坦病毒檢測(cè)的主要方法。該法雖能用于漢坦病毒分型，但存在實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)、工作量大等問(wèn)題。已有研究表明，依據(jù)M基因片段上部分核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，分型結(jié)果與血清學(xué)分型結(jié)果一致［5］?；诓《净蛐蛄袛?shù)據(jù)分析不但能對(duì)病毒進(jìn)行基因分型，而且也能較好地反映病毒間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。本研究根據(jù)GenBank中部分有代表性的毒株基因S片段序列設(shè)計(jì)引物，采用鄰位相連法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，以此方法對(duì)浙江省近年從野生嚙齒類(lèi)動(dòng)物中臨床分離的漢坦病毒毒株進(jìn)行分型鑒定，旨在探討適合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物漢坦病毒基因分型和種系發(fā)生重建的分子生物學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RNA提取試劑盒RNeasy Mini Kit購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司;克隆載體、T4連接酶、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA Taq酶、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)相關(guān)試劑、瓊脂糖凝膠純化試劑盒及質(zhì)粒DNA純化試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa中國(guó)分公司。引物合成由上海生工生物工程公司完成。HV直接熒光抗血清和HV單克隆熒光抗體均由浙江省腎綜合征出血熱重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 分析用漢坦病毒株

24株HV代表株序列下載自Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)，包括7種血清亞型，詳細(xì)信息見(jiàn)表1［5］。

表1 24株HV代表株的信息Tab.1 The information of 24 representative hantavirus strains

本研究選取11株HV實(shí)驗(yàn)毒株進(jìn)行系統(tǒng)分析， 這11株HV實(shí)驗(yàn)毒株分別為:天77-2、游10-31、泉547、龍泉、游 10-30、R88、N1、N2、N3 以及 1 株漢城病毒標(biāo)準(zhǔn)株N4(UR，SEO血清型)和1株HV標(biāo)準(zhǔn)株T8(76-118，HTN血清型)。上述實(shí)驗(yàn)毒株中，N4和 T8為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)采用了肺440、肺473、471、97這4個(gè)臨床檢測(cè)陰性樣本的DNA作為陰性對(duì)照。所有病毒DNA樣本及血清學(xué)鑒定信息均由浙江省腎綜合征出血熱重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。毒株信息詳見(jiàn)表2。

表2 研究中用于系統(tǒng)發(fā)生分析的HV株鑒定及其來(lái)源信息Tab.2 Identification and sources of hantavirus used for the phylogenetic analysis in the present study

1.3 引物設(shè)計(jì)

S片段的擴(kuò)增引物參考已知HV株的核苷酸序列，本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)并由上海生物工程公司合成，引物序列為上游引物:ATTAGCCCWGTCATGAGTGT，下游引物:CTTTGACTCYTTTGKYTCCA，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度201 bp。

1.4 RT-PCR擴(kuò)增

利用引物對(duì)上述病毒株進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的克隆及篩選方法見(jiàn)文獻(xiàn)［6］。具體步驟如下:

1.4.1 提取病毒總RNA

根據(jù)Qiagen的RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.4.2 反轉(zhuǎn)錄

以提取的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系為:模板 RNA(約 500 ng)1 μL，Random primers(25 μmol/L)1 μL，DEPC 水4 μL;70℃保溫10 min，迅速置冰浴2 min;再加入:5× MMLV buffer 2 μL，dNTP mix(10 mmol/L)0.5 μL，RNase inhibitor(40 U/μL)0.25 μL，RTase MMLV(200 U/μL)0.5 μL，DEPC 水 0.75 μL;總體積為 10 μL。反應(yīng)條件為:30℃保溫10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min。反應(yīng)結(jié)束后，迅速置于冰上冷卻，-20℃保存?zhèn)溆?以上所有操作均在冰上進(jìn)行)，獲得cDNA。

圖1 24株HV代表株S片段引物設(shè)計(jì)區(qū)基因的分型結(jié)果Fig.1 Genotyping results of S segments of 24 representative strains of hantavirus

1.4.3 PCR擴(kuò)增

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，利用上述設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為:模板0.5 μL，10× PCR buffer(含 Mg2+)2 μL，MgCl2(終濃度 2.5 mmol/L)2 μL，dNTP(終濃度 75 μmol/L)0.15 μL，Taq酶(0.75 U)0.15 μL，正反向引物(終濃度0.25 μmol/L)各0.5 μL，DEPC 水補(bǔ)足至20 μL 體系。反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min后，94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物電泳驗(yàn)證后，回收目的片段。

圖2 各病毒樣本的PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoresis map of PCR products from virus samples isolated from wild rodents in Zhejiang Province

1.5 核苷酸序列測(cè)定和分析

核苷酸序列測(cè)定由上海生物工程公司完成，將測(cè)定的序列結(jié)果應(yīng)用DNA STAR軟件(SeqMan)進(jìn)行拼接，應(yīng)用CLUSTALW軟件進(jìn)行多序列聯(lián)配，并MEGA 4.0軟件包進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，以鄰位相連法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 利用目標(biāo)序列構(gòu)建代表株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 24株HV代表株和11株實(shí)驗(yàn)毒株S片段引物設(shè)計(jì)區(qū)基因的分型結(jié)果Fig.3 Genotyping results of S segments of 24 representative strains and 11 wild-isolated strains of hantavirus

24株HV代表株的S片段序列均來(lái)自Gen-bank，通過(guò)BLASTN確定目標(biāo)序列區(qū)域，經(jīng)多序列聯(lián)配后，通過(guò)MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(NJ法)。該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)將所分析的毒株分為5個(gè)區(qū)域，即引起腎綜合征出血熱HTN、SEO、DOB、PUU血清型、以及引起漢坦病毒肺綜合征的Sin Nombre血清族(AND，BAY，SNV)(圖1)。引起HFRS的四種血清型具有較穩(wěn)定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，且能與引起HPS的血清型進(jìn)行區(qū)分。其中PUU血清型的毒株與引起HPS的HV具有更近的進(jìn)化距離。引起HPS的三種血清型親緣關(guān)系較近，其中AND血清型與BAY和SNV的差異較大，而后二者雖然形成較獨(dú)立的分區(qū)，但自展值較小(＜50)。

2.2 實(shí)驗(yàn)毒株的檢測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用本文設(shè)計(jì)的引物對(duì)實(shí)驗(yàn)毒株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該引物在11株實(shí)驗(yàn)毒株(含陽(yáng)性對(duì)照T8和N4)中擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，且產(chǎn)物大小與目標(biāo)區(qū)域一致，而陰性對(duì)照組中沒(méi)有條帶(圖2)。由此表明本引物對(duì)HV的檢測(cè)具有很好的敏感性和特異性。PCR產(chǎn)物隨后進(jìn)行測(cè)序和拼接，并加入24株代表株的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建(圖3)。結(jié)果表明系統(tǒng)發(fā)育分析將已知血清型的T8毒株分為HTN分支，N4毒株分為SEO血清型，另外9株血清型不明的毒株分為4個(gè)血清型，其中天77-2、游10-31和龍泉為HTN血清型，N1為SEO血清型;而其余5個(gè)毒株則形成較為獨(dú)立的兩個(gè)分支，即(N2，N3)和(泉547，游10-30，R88)，這兩個(gè)分支之間親緣關(guān)系較近，且與本文選取的5個(gè)代表性血清型具有較大的差異。

3 討論

PCR技術(shù)具有周期短，耗費(fèi)少且敏感性、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，在臨床檢驗(yàn)和生物安全等領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。國(guó)外大型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)構(gòu)在實(shí)施實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)和病原體診斷中，均將基于PCR的分子生物學(xué)檢測(cè)方法作為首選手段。在HV的檢測(cè)中，PCR方法可比血清學(xué)抗體方法早5～15 d檢測(cè)到陽(yáng)性結(jié)果［7］。本文報(bào)道了針對(duì)HV S片段進(jìn)行檢測(cè)的引物，系統(tǒng)發(fā)育分析表明該引物的目標(biāo)區(qū)域可對(duì)已知的代表株進(jìn)行準(zhǔn)確的分型。此前的研究報(bào)道S片段構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)不能準(zhǔn)確區(qū)分SEO和DOB兩種血清型［5］。本文的分析觀察到SEO和DOB血清型有更近的親緣關(guān)系，但目標(biāo)片段的系統(tǒng)發(fā)育分析能對(duì)其進(jìn)行較好的分類(lèi)。

本文同時(shí)利用所設(shè)計(jì)引物對(duì)浙江省現(xiàn)有的11株HV進(jìn)行了分型檢測(cè)，結(jié)果表明該引物具有高度的敏感性和特異性，提示其具有用以臨床檢測(cè)HV的價(jià)值。由于HV的自然宿主主要是小型嚙齒類(lèi)動(dòng)物，經(jīng)由排泄物、唾液、直接接觸或蟲(chóng)媒等傳染人，因此對(duì)嚙齒類(lèi)動(dòng)物的HV進(jìn)行快速檢測(cè)和分型將有助于HV流行病學(xué)調(diào)查和感染控制等后續(xù)處置工作。本研究所使用毒株均為浙江省各地近幾年從野生嚙齒類(lèi)動(dòng)物上分離的臨床毒株，具有一定的地域代表性。對(duì)其中9株嚙齒類(lèi)動(dòng)物分離獲得的血清型未知毒株的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)其包含引起HFRS的HTN(3株)和SEO(1株)血清型，其他5株HV屬于兩種未知血清型。下一步我們將對(duì)這5株病毒株進(jìn)行全基因組的分型測(cè)序，以探討說(shuō)明是否存在毒株變異的情況。

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