孫 旸，遲 惠，王 聰，陳 光

（吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118）

抗腫瘤19肽為腫瘤抑素（tumstatin）靠近C端的185～203位氨基酸，具有直接抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞凋亡的作用［1－2］。運用Westem印跡和親和層析法，TracyA，shahan等得到19肽的結合受體，發(fā)現(xiàn)該肽段是通過與腫瘤細胞表面的CD47/IAp（integrin associated protein）和αvβ3蛋白結合而發(fā)揮其作用。它與整合αvβ3、CD47/IAP復合體結合后，引起不同細胞的粘附、趨化以及增生的抑制，但這個肽段與細胞之間的作用卻不依賴于CD47，在CD47不存在的情況下，該肽也可以通過與αvβ3蛋白的亞單位結合激活粘著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）和磷脂酸肌醇激酶3（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3），PI 3激酶活化，后激活腺苷酸環(huán)化酶，從而使細胞內 cAMP 增加［3－5］。

本實驗將合成的表達載體pet32a－19肽分別轉化到4種不同型號的大腸桿菌中進行誘導表達［7］，通過對其蛋白表達量分析篩選出高效表達菌株，然后進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，并對其融合抗腫瘤19肽進行純化及其復性，為下一步抗腫瘤19肽活性實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組質粒pet32a－19肽，大腸桿菌 DH5α，BL21，BL21（DE3），BL21（DE3）plysS和 Rosetta（DE3） 由吉林農(nóng)業(yè)大學生物物理實驗室保存;酵母提取物（YE）、異丙基β－D硫代半乳糖苷（IPTG）和蛋白胨（OXOID） 購自北京鼎國生物工程有限公司;質粒小量提取試劑盒 購自愛思進公司;實驗中所用蛋白分子量標準 購自TaKaRa公司;Ni Sepharose 6 Fast Flow 購自長春百奧技術有限公司;其它試劑 國產(chǎn)分析純。

DYY－2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京六一儀器廠;Touching 956凝膠成像系統(tǒng) 上海天呈科技有限公司;JY98－3超聲波細胞破碎儀 寧波新芝科器研究所。

1.2 高效表達菌株的篩選

將重組質粒pET32a－19肽分別轉化到大腸桿菌BL21（DE3）plysS，BL21，BL21（DE3）和 Rosetta（DE3）四種感受態(tài)中。分別挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜。將菌液按1%的比例分別接種至LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6時，加入終濃度1mmol/L IPTG進行誘導，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)6h。取誘導后菌液離心收集菌體，以誘導空質粒轉化菌為陰性對照，取1mL菌液進行 SDS－PAGE電泳，上樣量為10μL，檢測菌體中蛋白的表達情況［5］。利用1DGelImageProcessingSoftware（Version 5.0.0.16 US）軟件對凝膠電泳結果分析，篩選出重組蛋白表達量最高的菌株作為工程菌株。

1.3 表達條件的優(yōu)化

挑取工程菌株接種于含Amp的LB固體培養(yǎng)基中，37℃倒置培養(yǎng)16h，然后挑取單菌落于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，180r/min振蕩培養(yǎng)過夜，作為種子液。按培養(yǎng)基的pH、接種量、IPTG的濃度、IPTG添加時機、誘導溫度和誘導時間設置單因素實驗［5］，誘導表達重組蛋白，每個單因素實驗設置3個重復。

1.3.1 培養(yǎng)基的 pH 分別配制 pH 為 5.0、6.0、6.5、7.0、7.5的LB 液體培養(yǎng)基，將種子液按1%的接種量分別接到上述50mL含Amp培養(yǎng)基中，37℃，200r/min振蕩培養(yǎng)至 OD600為 0.6時，加 IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃，180r/min 繼續(xù)誘導培養(yǎng)6h。

1.3.2 接種量 將種子液按1%、2%、3%、4%、5%的接種量分別接至pH為7.0的培養(yǎng)基中，其余條件與 1.3.1 相同。

1.3.3 誘導溫度 誘導溫度分別為 21、25、29、33、37、41℃，其余條件與 1.3.1 相同。

1.3.4 IPTG添加時間 振蕩培養(yǎng)至其 OD600達到0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 時添加 IPTG，其余條件與 1.3.1相同。

1.3.5 IPTG 的濃度 添加 IPTG 至終濃度為 0.1、0.5、1、1.5、2mmol/L，其余條件與 1.3.1 相同。

1.3.6 誘導時間 分別在 3、4、5、6、7h 后取樣，其余條件與 1.3.1 相同。

把上述的1mL菌液進行SDS－PAGE電泳，上樣量為10μL，檢測重組蛋白的表達情況并通過軟件1D Gel Image Processing Software（Version 5.0.0.16 US）進行分析。根據(jù)單因素結果，選用L18（37）正交實驗表進行實驗，將第七個因素做為空白對照，因素水平選擇如表1所示。

1.4 融合蛋白可溶性分析

通過最適條件誘導表達融合蛋白，4℃離心收集菌體。在PBS緩沖溶液中超聲破碎菌體（400W超聲2s間歇4s共100次），4℃離心，分別收集上清和沉淀進行SDS－PAGE電泳檢測，上樣量為10μL。

1.5 融合蛋白的純化和復性

4℃離心收集1L誘導菌液的菌體，用PBS緩沖溶液清洗菌體兩次，在 buffer1（50mmol/L Tris－HCl，0.2mol/L MEDTA，0.5mol/L NaCl，1%TritonX－100，1mol/L MPMSF，1mg/mL溶菌酶，7%甘油）中超聲破碎菌體（400W超聲2s間歇4s共100次），4℃離心收集沉淀，用 buffer2（在 buffer1中加入2mol/L的尿素），4℃離心收集沉淀用 buffer3（20mmol/L Tris－HCl，0.5mol/LNaCl，7% 甘 油）洗 滌 沉 淀 兩 次，用buffer4（8mol/L 尿素，20mmol/L 磷酸二氫鈉，0.5mol/L NaCl）溶解沉淀。4℃ 離心收集上清，用 0.45μm 過濾。因為目的蛋白是帶6個組氨酸標簽的融合蛋白，進而可按照Ni sepharose 6 Fast Flow使用說明書的操作方法對目的蛋白進行純化。分別用20mmol/L和40mmol/L咪唑洗滌跟柱子結合的雜蛋白，最后用300mmol/L咪唑洗下目的蛋白，并且收集樣品，對樣品進行SDS－PAGE電泳檢測分析組分的純度［6］。運用透析的方法進行復性，從5mol/L尿素逐步降低，分別配制透析液PBS含有10%甘油和5mol/L－0mol/L尿素，4℃攪拌分別10h，4℃離心收集上清進行SDS－PAGE電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 高效表達菌株的篩選

將重組質粒pET32a－19肽分別轉化到不同型號的大腸桿菌感受態(tài)細胞中，用IPTG誘導，對其誘導后的菌體進行SDS－PAGE蛋白電泳檢測，結果如圖1，與對照組相比，大約在21ku處出現(xiàn)一條明顯的表達條帶，與推測的理論值大小相符，說明目的基因在重組菌中得到了表達，后用軟件分析結果可知BL21（DE3）菌株表達量最高，大約18mg/L。

2.2 培養(yǎng)基pH的優(yōu)化

如圖2，通過軟件分析可知當培養(yǎng)基pH為7.0時重組蛋白的表達量最高，pH為5.0時表達量最小，pH為7.5時表達量開始降低，說明重組菌在培養(yǎng)基pH為7.0時適合表達目的蛋白，而過酸過堿都會影響目的蛋白的表達。

2.3 接種量的優(yōu)化

如圖3，通過軟件分析可知，接種量為3%時目的蛋白的表達量最高，接種量繼續(xù)增加時，目的蛋白的表達量開始下降，而接種量為1%時表達量也很低。

2.4 誘導溫度的優(yōu)化

表1 正交實驗設計Table 1 Orthogonal experimental design

圖1 高效表達菌株的篩選Fig.1 The screening of efficient recombinant bacteria

圖2 不同pH培養(yǎng)基對重組蛋白表達的影響Fig.2 Influence of pH on the expression of recombinant protein

圖3 不同接種量對蛋白表達的影響Fig.3 Influence of inoculation volume on the expression of recombinant protein

過低或過高的溫度都會影響菌體的生長與代謝。如圖4，在37℃時目的蛋白的表達量最高。

2.5 IPTG添加時間的優(yōu)化

誘導劑添加時間對目的蛋白的表達有很大的影響，如圖5，OD600為0.7時目的蛋白表達量最高。過早或過晚添加IPTG都會影響目的蛋白的表達。

2.6 IPTG添加濃度的優(yōu)化

不同濃度的IPTG對目的蛋白表達有一定的影響，如圖6。在1.0mmol/L時目的蛋白的表達量最高，隨著濃度增加目的蛋白的表達量開始減少，因為高濃度的IPTG會對菌體產(chǎn)生毒副作用。

圖4 不同溫度對重組蛋白表達的影響Fig.4 Influence of induction temperature on the expression of recombinant protein

圖5 不同IPTG添加時間對重組蛋白表達的影響Fig.5 Influence of induced opportunity on the expression of recombinant protein

圖6 不同IPTG濃度對重組蛋白表達的影響Fig.6 Influence of concentration of IPTG on the expression of recombinant protein

2.7 誘導時間的優(yōu)化

誘導時間長短對目的蛋白表達量有一定的影響，如圖7，軟件分析可知，誘導后3h到6h，目的蛋白的表達量逐漸上升，在誘導6h后表達量達到最高，之后由于菌體的衰老，合成能力開始降低，甚至代謝產(chǎn)生出有害的產(chǎn)物，目的蛋白表達量逐漸下降。

2.8 正交實驗結果

采用七因素三水平正交表設計正交實驗，實驗結果如圖8，采用1D Gel Image Processing Software（Version 5.0.0.16 US）軟件分析，結果見表 2。根據(jù)極差分析由表3可知，在六個因素中因素F影響最大，C、E、A、B、D的影響依次減小。從正交結果中來看，A2B1C1D2E2F3表達量最高，可以達到54.57mg/L。根據(jù)極差和方差的影響大小選取的組合條件為A2B3C1D3E2F3，考慮IPTG具有一定的毒性和成本高，OD600的影響是最小的，所以選用A2B1C1D2E2F3作為最優(yōu)發(fā)酵條件。

表2 正交實驗結果Table 2 Orthogonal experiment results

圖7 不同誘導時間對重組蛋白表達的影響Fig.7 Influence of induced time on the expression of recombinant protein

表3 正交設計方差分析表Table 3 Variance analysis of orthogonal arrayfor fermentation condition

圖8 正交實驗結果SDS－PAGE電泳鑒定Fig.8 Identification of orthogonal experimental results by SDS－PAGE

2.9 融合蛋白可溶性分析

如圖9所示，重組蛋白主要存在于超聲后的沉淀中，因此主要以包涵體形式進行表達。

2.10 融合蛋白的純化和復性

圖9 重組蛋白可溶性SDS－PAGE分析Fig.9 The analysis of recombinant soluble protein by SDS－PAGE

超聲破碎菌體，洗滌包涵體，再經(jīng)8mol/L尿素溶解，經(jīng)Ni sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，純化出的蛋白通過梯度透析方法進行復性。SDSPAGE電泳顯示（圖10），純化出的融合抗腫瘤19肽純度很高，運用軟件分析純度達到95%。目的蛋白復性可能造成一定量的損失，目的蛋白濃度降低，從圖11中可以看出復性后的蛋白沒有被降解或形成二聚體。

圖10 重組蛋白的純化Fig.10 Recombinant protein purification results by SDS－PAGE

圖11 重組蛋白的復性Fig.11 Recombinant protein purification refolding results by SDS－PAGE

3 結論與討論

為了獲得大量的重組蛋白，不僅要選擇理想的表達載體和宿主菌，還需要優(yōu)化誘導表達條件。不同型號的大腸桿菌促進合成的代謝產(chǎn)物是有區(qū)別的，所以表達的目的蛋白含量也不相同，用重組質粒轉化到不同型號的大腸桿菌，才能找出最適合表達目的蛋白的工程菌株。本實驗通過將重組質粒pET32a－19肽分別轉化到不同型號的大腸桿菌中，篩選出高效表達菌株pET32a－19肽－BL21（DE3），在沒有優(yōu)化誘導表達條件的情況下就可以達到18mg/L。BL21（DE3）是一種常規(guī)表達宿主菌，可以保護lon和ompT蛋白酶對目的蛋白酶的降解，而且是最常用的表達宿主菌。BL21（DE3）菌株不具有抗生素的抗性，可以節(jié)約成本。何莉，鮮盡紅等人用重組工程菌pET32a－CR1－SCR15－18/BL21（DE3）在高密度發(fā)酵中得到了，菌體產(chǎn)量為40g/L，CR1－SCR15－18蛋白表達率為28%［13］。因此，可以從高密度發(fā)酵來提高融合抗腫瘤19肽的表達量。

工藝研究不同pH的培養(yǎng)基會影響菌體的生長狀態(tài)或菌體本身的酶促反應，從而使重組蛋白的表達量出現(xiàn)差異［7－8］。接種量過少時菌體繁殖緩慢，導致整個生長周期變長，當接種量過多時導致菌體生長過快，對培養(yǎng)基中營養(yǎng)及溶氧的消耗加速，都不利于目的蛋白的表達。微生物在發(fā)酵過程中伴隨著很多酶促反應，來控制菌體的生長及代謝產(chǎn)物的合成，所以溫度對于發(fā)酵是很重要的因素。過早添加IPTG會影響細菌的增殖，菌體的量相對較少，導致蛋白的表達量低;過晚添加IPTG，菌體處于穩(wěn)定期或后期，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和氧氣量降低，并且代謝速度減慢，合成物質的能力降低，蛋白的表達量降低［9－10］。IPTG具有毒性，而且價格比較高，過高會影響菌體的生長代謝，過少會對菌體的誘導力度不夠，從而影響目的蛋白的表達，所以要選擇合適的IPTG添加濃度［11－12］。通過對工程菌株在接種量、培養(yǎng)基的 pH、溫度、IPTG濃度、誘導時間和IPTG添加時間六個影響因素上進行發(fā)酵條件的優(yōu)化，篩選出最適合工程菌株的發(fā)酵條件為培養(yǎng)基的pH為7.0、接種量為3%、IPTG 濃度 0.1mmol/L、IPTG 添加時間 OD600為 0.7、誘導溫度為41℃和誘導時間5h，通過軟件分析重組目的蛋白的表達量高達54.57mg/L。搖瓶發(fā)酵產(chǎn)重組蛋白的量是有限的，應繼續(xù)進行高密度發(fā)酵。

原核誘導表達重組蛋白，形成的包涵體可以減少蛋白酶對其降解和提高表達產(chǎn)量，通過對其包涵體進行不同方式的洗滌，更利于分離目的蛋白。在洗滌包涵體的過程中加入了2mol/L的尿素、1%TritonX－100和EDTA洗去可溶的粘附的細菌蛋白，通過不同溶液洗滌，得到了較高純度的包涵體，有利于之后的蛋白純化。pET32a質粒帶有組氨酸標簽，可以運用親和層析的方法純化目的蛋白，方便簡單。因此pET32a－19肽－BL21（BE3）表達的融合蛋白可以通過Ni sepharose 6 Fast Flow親和層析柱純化，得到目的蛋白，運用軟件分析純度達到95%。透析對于蛋白復性來說是比較穩(wěn)定和有效的方法，但其缺點是需要大量的透析液。運用梯度透析的方法，復性了純化出的目的蛋白，但在復性過程中出現(xiàn)了少量的沉淀，可能是蛋白復性過程中錯誤折疊，使復性出的蛋白減少，有部分蛋白被復性成功。為以后的抗腫瘤融合19肽的活性實驗奠定了基礎。

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