王海鳴，嚴志紅

(1.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣州 510656； 2.廣東藥學(xué)院，廣州 510006)

高效液相色譜法測定葛根芩連片中的葛根素

王海鳴1，嚴志紅2

(1.廣州廣電計量檢測股份有限公司，廣州 510656； 2.廣東藥學(xué)院，廣州 510006)

建立高效液相色譜測定葛根芩連片中葛根素含量的方法。以體積分數(shù)50%的甲醇為提取液對樣品超聲提取20 min，采用DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm ，5μm)色譜柱，以甲醇-乙腈-水(體積比8∶12∶80)為流動相，流速為1.0 mL／min，檢測波長為250 nm，柱溫為30.0℃，進樣量體積10 μL。在最佳實驗條件下，葛根素與其它物質(zhì)能完全分離，葛根素的質(zhì)量濃度在5.43～543.2 μg／mL范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，方法檢出限為3.50 μg／mL (S／N=3)。方法加標回收率為100.0%，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.6% (n=6)。該方法簡單、快速、重現(xiàn)性好，適用于葛根芩連片中葛根素的測定。

高效液相色譜；葛根芩連片；葛根素

葛根芩連片是由葛根、黃芩、黃連組成的中藥制劑，具有清熱解毒、止瀉止痢的作用，臨床用于治療泄瀉、痢疾、身熱煩渴等癥［1］，其中葛根為方中君藥，而葛根素為葛根的主要活性成分之一，具有活血通脈，解肌退熱，升陽止瀉的功能［2］。相關(guān)制劑在2010年版《中國藥典》中收載，葛根素為葛根質(zhì)量控制的主要成分，對其提取及含量測定方法進行研究具有重要意義。

葛根芩連片中葛根素，常以加熱回流進行提取后制成供試品溶液由高效液相色譜法進行測定［3-5］，但提取方法較繁瑣［6］。筆者采用超聲提取-高效液相色譜法進行了葛根芩連片中葛根素的測定，優(yōu)選了提取溶劑和提取時間。該方法簡便、提取完全，定量分析結(jié)果的精密度、準確度較高。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：由高壓泵(LC-10ATvp型)、自動進樣器(SIL-20A型)、柱溫箱(CTO-10Asvp型)、二極管陣列檢測器(SPD-M10Avp型)、工作站(LCsolution型)組成，日本島津公司；

超聲波清洗儀：DL-360A型，日本島津公司；

葛根素對照品：編號為110752-200912，中國藥品生物制品檢定研究院；

葛根芩連片：商品名為暢康寧，批號分別為090301，090501，090701，山西省恒山中藥有限責(zé)任公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國默克公司；

色譜使用雙蒸水，其它實驗用水為蒸餾水；

實驗所用其它試劑均為分析純。

1.2 色譜條件

色譜柱：DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：甲醇-乙腈-水(體積比8∶12∶80)，流速為1.0 mL／min；檢測波長：250 nm；柱溫：30℃；進樣體積：10 μL。

1.3 溶液制備

(1)葛根素對照品溶液的制備。精密稱取葛根素對照品適量，以50%甲醇溶解并定容于50 mL的容量瓶中，質(zhì)量濃度為543.2 μg／mL，使用時按需稀釋；

(2)葛根素供試品溶液的制備。取葛根芩連片20片，研細得粉末，精密稱取粉末0.15 g，置于50 mL的容量瓶中，加入50%甲醇25 mL，振搖溶解，超聲20 min，放置冷卻，以50%甲醇定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得葛根素供試品溶液。

(3)葛根素陰性對照溶液的制備。根據(jù)葛根芩連片藥品說明書及廠家提供的制劑配方，配制不含葛根的陰性對照粉末。精密稱取陰性對照0.15 g，按照上述(2)方法制得葛根素陰性對照溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長

根據(jù)葛根素標準溶液的二極管陣列紫外圖譜可知，葛根素在250 nm處有最大吸收，因此實驗選擇250 nm為葛根素的檢測波長。

2.2 提取溶劑

設(shè)置超聲提取時間為20 min，其它條件保持不變，分別試驗了以體積分數(shù)10%，30%，50%，70%，100%甲醇為提取劑時超聲提取效果（以葛根素峰面積為指標)。結(jié)果表明，經(jīng)上述不同體積分數(shù)甲醇提取后，葛根素平均色譜峰面積分別為2.25×107，2.36×107，2.38×107，2.26×107，1.94×107，因此超聲提取溶劑選擇50%甲醇。

2.3 提取時間

以50%甲醇為提取溶劑，其它條件保持不變，分別考察超聲提取時間為10，20，30，40，50 min時的提取效果（以葛根素峰面積為指標)。結(jié)果顯示，在上述不同提取時間下，葛根素平均色譜峰面積為2.14×107，2.44×107，2.46×107，2.46×107，2.45×107?？紤]到20 min以后葛根素峰面積變化不大，實驗選擇超聲提取時間為20 min。

2.4 流動相

流動相為甲醇-水，峰形較差，出峰比較快，容易受到其它雜質(zhì)的干擾；當(dāng)選擇甲醇-乙腈-水(8∶12∶80)為流動相，流速為1.0 mL／min時，色譜峰形好，葛根素的分離度符合要求，靈敏度高，保留時間適中。

2.5 專屬性試驗

分別取葛根素對照品溶液、葛根素供試品溶液和葛根素陰性對照溶液進樣分析，所得色譜圖見圖1～圖3。由圖1～圖3可見，在選定的色譜條件下，供試品中葛根素與其它雜質(zhì)能完全分離且陰性對照無干擾，葛根素保留時間約為15.4 min，理論塔板數(shù)以葛根素計不低于3 000。

圖2 葛根芩連片供試溶液HPLC圖

圖3 不含葛根的陰性對照溶液HPLC圖

2.6 標準曲線方程及檢出限

分別精密移取葛根素對照品溶液適量，適當(dāng)稀釋得質(zhì)量濃度為543.2，271.6，135.8，54.32，27.16，13.58，5.432 μg／mL的系列標準溶液，在1.2色譜條件下分別進樣分析。以葛根素色譜峰面積(A)為縱坐標，葛根素質(zhì)量濃度(c)為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=38 248c-44 170，相關(guān)系數(shù)r＝0.999 9，線性范圍為5.43～543.2 μg／mL。以3倍標準偏差計算(S／N=3)檢出限為3.50 μg／mL。

2.7 供試品溶液穩(wěn)定性試驗

對批號090501樣品按1.3(2)制備供試品溶液一份，在1.2色譜條件下，分別按時間間隔0，2，4，6，8，10，12 h進樣分析，結(jié)果見表1。由表1可知，測定結(jié)果的相對標準偏差為1.8%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

表1 供試品溶液穩(wěn)定試驗結(jié)果

2.8 精密度試驗

精密稱取批號090501的葛根芩連片樣品共6份，按照1.3(2)方法制備供試品溶液，在1.2色譜條件進行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，葛根素含量測定結(jié)果的相對標準偏差為1.5%，說明所建方法精密度良好。

表2 精密度試驗結(jié)果(n=6)

2.9 回收試驗

精密稱取葛根芩連片樣品(批號090501)6份，按1.3(2)方法制備供試品溶液，進樣分析。然后分別加入質(zhì)量濃度為543.2 μg／mL的葛根素對照品溶液2.00 mL，進行加標回收試驗，結(jié)果見表3。由表3可知，平均回收率為100.0%，說明方法的準確度較高。

2.10 樣品測定

按1.3(2)方法將3批葛根芩連片樣品(090301，090501，090701)分別制成供試品溶液，每批3份，分別進樣測定，計算樣品中葛根素含量，結(jié)果見表4。由表4可知，3批樣品中的葛根素含量相差不大，測定結(jié)果的相對標準偏差均小于2.0%。由此可見方法測量的精密度良好。

表3 回收試驗結(jié)果(n=6)

表4 樣品中葛根素的含量測定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)語

采用超聲提取-高效液相色譜法測定葛根芩連片中有效成分葛根素含量，優(yōu)選了提取溶劑和提取時間，該法具有快速簡便、穩(wěn)定性好、結(jié)果精確高的特點，可作為葛根制劑質(zhì)量控制的方法。

［1］唐波，王小寧.葛根芩連湯精制顆粒治療濕熱泄瀉臨床研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2010，10(11): 920-922.

［2］宋煒，高衛(wèi)華.葛根素的藥理作用解析及臨床用途［J］.中外醫(yī)療，2011(4): 139.

［3］吳永芹，馮凱，周慧，等.HPLC法同時測定葛根芩連片中葛根素和黃芩苷的含量［J］.中國藥事，2012，26(3): 282-284.

［4］張雋，張祥偉，黃添友，等.葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片葛根素溶出量及藥效作用對比研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2011，22(2): 358-361.

［5］鄧開英，王曉琳，夏永鵬，等.葛根芩連片中3種活性成分的HPLC法測定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2011，42(10): 784-786.

［6］駱紅飛，黃麗娜.反相高效液相色譜法測定葛根芩連丸中葛根素的含量［J］.浙江中醫(yī)雜志，2013，48(3): 225-226.

Determination of Puerarin in Gegenqinlian Tablet by HPLC

Wang Haiming1，Yan Zhihong2
(1. Guangzhou GRG Metrology & Test Co. Ltd., Guangzhou 510656，China；2.Guangdong Pharmaceutical University，GuangZhou 510006，China)

HPLC method was established for the determination of puerarin in Gegenqinlian tablet. The sample was extracted by ultrasonic with 50% methanol and extraction time of 20 min. The diamonsilTMC18(250 mm ×4.6 mm 5μm) column was used with methanol-acetonitrile-water (volue rate was 8∶12∶80) as the mobile phase，the flow rate was 1.0 mL／min，detection wavelength was 250 nm，column temperature was 30.0℃ and injection volume was 10 μL. HPLC method could completely separated puerarin from other substances under the optimum experimental conditions. The concentration of puerarin was linear with peak area in the range of 5.43-543.2μg／mL，the linear correlation coefficient was 0.999 9，and the detection limit was 3.50 μg／mL. The average recovery of method was 100.0% and the relative standard deviation was 1.6% (n=6). The method is simple，rapid，reproducible，and it is suitable for the determination of puerarin in Gegenqinlian tablet.

HPLC; Gegenqinlian tablet; puerarin

O657.7

A

1008-6145(2014)04-0070-03

10.3969／j.issn.1008-6145.2014.04.021

聯(lián)系人：嚴志紅；E-mail: yzhxsp@aliyun.com

2014-05-08