李春霞

摘要：為了優(yōu)化蛭弧菌的生長(zhǎng)條件，在前期研究確定適于蛭弧菌BD1生長(zhǎng)的最佳pH、鹽度、二價(jià)金屬離子（Ca2+、Mg2+）、谷氨酸鈉的濃度范圍的基礎(chǔ)上，綜合考慮4個(gè)因子對(duì)蛭弧菌BD1生長(zhǎng)的影響，利用Design Expert 6.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，優(yōu)化菌體生長(zhǎng)條件，得到該菌株生長(zhǎng)模型，并在模型最優(yōu)值時(shí)得到各因子的水平。結(jié)果表明：BD1的最優(yōu)培養(yǎng)條件為鹽度（NaCl濃度）為2.9%，培養(yǎng)液pH值為7.4，Ca2+、Mg2+濃度為6.4 mmol，谷氨酸鈉濃度為4.2 mmol。菌體生長(zhǎng)過(guò)程中，鹽度和二價(jià)金屬離子，谷氨酸鈉和二價(jià)金屬離子，谷氨酸鈉與鹽度交互作用不顯著，pH與鹽度，pH與谷氨酸鈉，pH與二價(jià)金屬離子交互作用顯著。菌體生長(zhǎng)模型達(dá)到顯著水平，可以對(duì)BD1在不同條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面； 蛭弧菌； 生長(zhǎng)條件

中圖分類號(hào)：Q93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-1098（2014）01-0067-05

蛭弧菌（Bdellovibrio）是一類寄生于其它細(xì)菌并導(dǎo)致其裂解的寄生性細(xì)菌[1]。蛭弧菌具有類似噬菌體的功能，對(duì)自然環(huán)境中的細(xì)菌具有很強(qiáng)的裂解作用，其與宿主間并沒(méi)有嚴(yán)格的特異性，有研究表明，蛭弧菌能裂解大多數(shù)科屬的革蘭氏陰性菌和少數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌[2]，能對(duì)導(dǎo)致人類食物中毒和漁業(yè)養(yǎng)殖病害的致病菌具有良好的裂解清除效果，且對(duì)動(dòng)植物無(wú)毒副作用[3]。

響應(yīng)面方法（Response Surface Methodology）是解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法，其首先進(jìn)行合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)得到相應(yīng)數(shù)據(jù)，運(yùn)用多元二次回歸方程擬合各因素與響應(yīng)值的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的顯著分析來(lái)尋求最優(yōu)的條件參數(shù)[4]。應(yīng)用Design-Expert軟件系統(tǒng)對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，擬合曲線，建立數(shù)學(xué)模型，檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷暮线m性，利用三維立體圖形，觀察響應(yīng)曲面，尋求最佳組合條件[5]。

本文在研究影響蛭弧菌BD1生長(zhǎng)的pH、鹽度（NaCl）、二價(jià)金屬離子（Ca2+、Mg2+）和谷氨酸鈉4個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面分析法，以pH值、鹽度、二價(jià)金屬離子（Ca2+、Mg2+）和谷氨酸鈉為響應(yīng)因素，以菌體濃度的對(duì)數(shù)值為響應(yīng)值，用Design-Expert 60的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）建立響應(yīng)曲面模型，優(yōu)化蛭弧菌BD1的生長(zhǎng)條件。

1材料和方法

菌種：蛭弧菌BD1、宿主菌由本實(shí)驗(yàn)室分離保存

培養(yǎng)基：DNB雙層平板培養(yǎng)基等均按照參考文獻(xiàn)[6]配制。

11宿主菌培養(yǎng)

宿主菌接種于滅菌的2216E液體培養(yǎng)基中，置于轉(zhuǎn)速為200（r·min-1），溫度為28 ℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14～15 h，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

12蛭弧菌的培養(yǎng)

將懸浮好的蛭弧菌與宿主菌以體積比2∶5均勻混合并靜置30 min，取07 mL混合液與35 mL 50 ℃的DNB上層培養(yǎng)基均勻混合并傾注于DNB下層平板中。將DNB雙層平板倒置于溫度為28℃的恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)48～72 h。

13實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（Central Composite Design，CCD）是最常用的響應(yīng)面分析法，適用于2～5個(gè)因素的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。采用該法能夠在有限的試驗(yàn)次數(shù)下，對(duì)因子及其交互作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，而且還能對(duì)各因子進(jìn)行優(yōu)化，以獲得影響過(guò)程的最佳條件。根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)蛭弧菌的生長(zhǎng)繁殖能力具有明顯影響的4個(gè)因素，包括二價(jià)離子（Mg 2+、Ca2+）（x1）、鹽度（x2）、谷氨酸鈉（x3）和pH（x4），每個(gè)因素選取5個(gè)水平， 分別以-2，-1，0，1和2進(jìn)行編碼（見(jiàn)表1），根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表2）進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)，研究蛭弧菌的最佳培養(yǎng)條件，為蛭弧菌的發(fā)酵培養(yǎng)提供理論基礎(chǔ)。

14培養(yǎng)方法

取30個(gè)150 mL的三角瓶，每瓶中精確地分裝50 mL新配置的DNB液體培養(yǎng)基，根據(jù)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表2）調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基的pH、鹽度、谷氨酸鈉和Ca2+、Mg2+濃度，高壓滅菌后待用。向每瓶培養(yǎng)基中添加蛭弧菌和宿主菌，使其濃度分別達(dá)到2×102 PFU/mL和2×1010 CFU/mL。在恒溫?fù)u床中（250 r·min-1）培養(yǎng)24 h，采用DNB雙層平板法檢測(cè)瓶中蛭弧菌的濃度。中心組合實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)以減少實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平行實(shí)驗(yàn)的平均值。

15驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以響應(yīng)面分析法得到的BD1的最佳生長(zhǎng)條件，做3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果的相符性驗(yàn)證響應(yīng)面分析方法的可靠性。

2結(jié)果與分析

中心組合實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，經(jīng)Design Expert 60軟件用標(biāo)準(zhǔn)多項(xiàng)式回歸法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析擬合后得到如下二次回歸方程

模型的方差分析結(jié)果如表3所示， 在置信度水平α=001時(shí)， 該回歸模型極顯著， 方程確定系數(shù)R2=09949， 失擬項(xiàng)不顯著， 說(shuō)明對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行很好的擬合， 代表性較好， 進(jìn)而可用該方程代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。同時(shí)，變差系數(shù)CV=475%相對(duì)較低，說(shuō)明整個(gè)試驗(yàn)具有良好的精密度和可靠性。

模型回歸方程系數(shù)的顯著性檢測(cè)結(jié)果如表4所示， pH對(duì)蛭弧菌生長(zhǎng)活性有極顯著的影響（P<00001），谷氨酸鈉濃度、鹽度和二價(jià)金屬離子濃度則對(duì)蛭弧菌的生長(zhǎng)繁殖能力具有顯著的影響（P<005）。二次項(xiàng)（x21、x22、x23和x24）均極顯著，且交互項(xiàng)（x2x3和x3x4）顯著（P<005），說(shuō)明各因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不僅僅是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，而是存在一定的交互作用，模型響應(yīng)面如圖1～圖6所示。

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩個(gè)因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著[7]。從圖1～圖6可以直觀地看出，鹽度和二價(jià)金屬離子，谷氨酸鈉和二價(jià)金屬離子，谷氨酸鈉與鹽度交互作用不顯著；pH與鹽度，pH與谷氨酸鈉，pH與二價(jià)金屬離子交互作用顯著。

模型優(yōu)化結(jié)果顯示， 當(dāng)x1=-031， x2= -024，x3=-041，x4=038，即Ca2+、Mg2+濃度為638（mmol·L-1），鹽度為288%，谷氨酸鈉濃度為418（mmol·L-1），pH為738時(shí)，蛭弧菌的生長(zhǎng)繁殖能力最強(qiáng)，此時(shí)模型預(yù)測(cè)蛭弧菌濃度對(duì)數(shù)值達(dá)到846。

為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷目煽啃?，采用上述?yōu)化條件培養(yǎng)蛭弧菌，考慮到實(shí)際操作的便利，將優(yōu)化條件修正為Ca2+、Mg2+濃度為64（mmol·L-1），鹽度為29%，谷氨酸鈉濃度為42（mmol·L-1），pH為74，實(shí)際測(cè)得的蛭弧菌的濃度對(duì)數(shù)值為895，與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為58%，因此通過(guò)該模型優(yōu)化得到的蛭弧菌BD1的最佳培養(yǎng)條件準(zhǔn)確可靠，具有一定的理論價(jià)值。

3結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析方法，根據(jù)中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)了四因素五水平實(shí)驗(yàn)，采用Design-Expert軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)， 得到了菌體生長(zhǎng)模型， 以及模型最優(yōu)時(shí)各因素的水平。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： BD1的最佳生長(zhǎng)條件為： Ca2+、Mg2+濃度為64（mmol·L-1），鹽度為29%，谷氨酸鈉濃度為42（mmol·L-1），pH為74。在該培養(yǎng)條件下，菌體生長(zhǎng)模型達(dá)到顯著水平，模型可以對(duì)蛭弧菌BD1在不同條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，為蛭弧菌的培養(yǎng)和應(yīng)用提供理論參考。

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（責(zé)任編輯：李麗，范君）