盧華杰，盧燕，劉焱文

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北省中藥資源與中藥化學(xué)重點實驗室，湖北武漢430061）

茯苓多糖抗氧化作用研究

盧華杰，盧燕，劉焱文*

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北省中藥資源與中藥化學(xué)重點實驗室，湖北武漢430061）

比較研究茯苓水溶性多糖、酸性多糖及其不同酸度多糖的抗氧化作用，為茯苓多糖開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。采用水和1mol/LNaOH溶液分別提取得到茯苓水溶性多糖（PWP）及酸性多糖（PAP）；取水提取茯苓水溶性多糖后的藥渣，依次用0.1mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液分級提取分離10種茯苓酸性多糖組分（PSAP1-PSAP10）。通過對多糖還原能力、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率等指標的測定，比較PWP、PAP和10種PSAP1→PSAP10組分的抗氧化活性。研究結(jié)果表明，PWP和PAP具有抗氧化作用；PSAP1→PSAP10分級提取的10種多糖組分均具有不同程度的抗氧化作用，其中PSAP8和PSAP9抗氧化作用優(yōu)于其他組分。綜合分析，茯苓多糖具有良好的抗氧化作用，其酸性多糖的抗氧化作用與其酸性強弱相關(guān)。

茯苓多糖；酸性多糖；分級提?。豢寡趸?/p>

茯苓為多孔菌科真菌茯苓（Poria cocos（Schw.）Wolf）的干燥菌核，是常用藥食兩用傳統(tǒng)中藥大品種。茯苓收載于歷年版《中國藥典》，具有滲濕利尿、和胃健脾、靈心安神之功效，廣泛用于臨床治療和養(yǎng)身保健。據(jù)第三次全國中藥資源普查統(tǒng)計，在數(shù)以萬計的中藥復(fù)方中的配伍率達70%以上，以其為原料或配方的中成藥制劑300余種；以茯苓為原料制作的保健食品數(shù)十種，備受人們歡迎，茯苓餅、茯苓酒、茯苓糕、茯苓糖、茯苓茶、茯苓面等產(chǎn)品在市場上隨處可見?，F(xiàn)代藥理研究表明，茯苓具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫功能、保肝健脾、鎮(zhèn)靜安神、利水消腫、抗炎抑菌、抗突變、抗衰老、抗過敏等多方面的藥理作用，其有效成分為茯苓多糖和三萜類成分。茯苓多糖為該藥材的主要成分，其中酸性多糖含量達84.2%以上。中藥多糖類物質(zhì)抗氧化作用研究報道較多[1-2]，成為當今熱點研究課題。羧甲基茯苓多糖抗氧化作用已見文獻報道[2]，但茯苓酸性多糖直接抗氧氧化作用尚未見文獻報道。本論文采用溶劑法，提取分離茯苓水溶性多糖（PWP）、茯苓酸性多糖（PAP）和0.1mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液分級分離的10種茯苓酸性多糖組分（PSAP1→PSAP10）。通過多糖還原能力、DPPH自由基清除率和羥基自由基清除率等測定指標，對上述提取分離的各種茯苓多糖樣品進行了抗氧化作用的比較研究，以期為茯苓多糖的開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓飲片：購自于湖北羅田“九資河茯苓規(guī)范化種植基地”；二苯代苦味肼基自由基（DPPH）：Sigma公司；雙氧水30%（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：上海實驗試劑有限公司；FeCl3、FeSO4、水楊酸、三氯乙酸、鐵氰化鉀、無水乙醇等均為分析純。

1.2 儀器

10萬分之一天平（BP211D）：SARTORIUS；離心機TGL-16G：上海安亭科學(xué)儀器廠；電熱恒溫水浴鍋：上海東星建材實驗設(shè)備有限公司；UV-2401PC：SHIMADZU。

1.3 方法

1.3.1 茯苓多糖的提取

取茯苓塊100 g，加8倍量水加熱回流提取3次，每次1 h，合并濾液，濃縮干燥得茯苓水溶性多糖（PWP）；藥渣烘干后用70倍量1mol/L的NaOH溶液室溫攪拌提取2 h，500目濾布過濾，濾液用20%的HCl中和，得茯苓總酸性多糖（PAP）沉淀；取適量經(jīng)水提取后的茯苓藥渣，通過0.1 mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液依次分級提取10種茯苓酸性多糖組分，即PSAP1、PSAP2、PSAP3、PSAP4、PSAP5、PSAP6、PSAP7、PSAP8、PSAP9、PSAP10等10個酸性多糖組分，經(jīng)除鹽后干燥備用。

1.3.2 茯苓多糖的還原能力測定[1]

精密稱取茯苓多糖各供試品樣品，用DMSO溶解，配制成濃度為2mg/mL的供試品溶液。精密量取供試品溶液1mL，加入2.5mL的磷酸鹽緩沖液（pH6.6）和2.5mL1%鐵氰化鉀溶液混勻，50℃恒溫20min，再加入2.5mL10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10min，取上清液2.5mL，加入蒸餾水2.5mL和0.5mL 0.1%氯化鐵溶液，在700 nm波長處測定吸光度，吸光度越大，還原能力越強。

1.3.3 茯苓多糖對DPPH自由基清除率的測定[1]

精密稱取茯苓多糖各供試品樣品，用DMSO溶解，配制成濃度為2mg/mL的供試品溶液。精密量取供試品溶液2mL，加入2mL質(zhì)量濃度為0.025mg/mL的DPPH乙醇溶液，混勻，靜置30min，3 000 r/min離心10min，取上清液，于517 nm波長處測定吸光度，按下列公式計算清除率。

式中：SE為清除率；Ai為2mLDPPH溶液+2mL樣品溶液吸光度；Aj為2mL無水乙醇+2mL樣品溶液吸光度；A0為2mLDPPH溶液+2mL雙蒸水吸光度。

1.3.4 茯苓酸性多糖對羥基自由基清除率的測定[3]

精密稱取茯苓多糖各供試品樣品，用DMSO溶解，配制成濃度為2mg/mL的供試品溶液。精密量取供試品溶液1mL，加入1mL 6mmol/LFeSO4溶液，混勻后加入1mL 6mmol/LH2O2溶液，混勻后靜置10min，加入1mL 6mmol/L水楊酸溶液，空白對照為DMSO，混勻后38℃水浴30min，3 000 r/min離心10min，取上清液于510 nm波長處測定其吸光度，按下列公式計算清除率。

式中：SE為清除率；Ai為樣品溶液的吸光度；Aj為雙蒸水替代水楊酸時樣品溶液的吸光度；A0為空白對照吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 茯苓多糖的還原能力

抗氧化活性成分通過其還原作用清除自由基，還原能力越強，抗氧化活性越強。采用1.3.2所述方法分別測定茯苓多糖各供試樣品（PWP、PAP、PSAP1→PSAP10）的還原能力，并進行比較，結(jié)果如圖1所示。

圖1 茯苓多糖還原能力Fig.1 Deoxidization ability of polysaccharide from Poria cocos

由圖1可見，茯苓多糖的各供試樣品均具有一定還原能力，其中茯苓水溶性多糖的還原能力高于茯苓總酸性多糖，但分級提取的酸性多糖組分PSAP7、PSAP9、PSAP10的還原能力高于PWP。

2.2 茯苓多糖對DPPH自由基清除率

DPPH自由基清除率的測定是篩選和評價抗氧化活性物質(zhì)的有效方法。采用1.3.3所述方法分別測定茯苓多糖各供試樣品（PWP、PAP、PSAP1→PSAP10）對DPPH自由基的清除能力，并進行比較，結(jié)果如圖2所示。

圖2 茯苓多糖對DPPH自由基清除率Fig.2 The scavenging activity on DPPH free ridical of polysaccharide from Poria cocos

由圖2可見，茯苓多糖各供試樣品均對DPPH自由基有一定清除作用，其中茯苓水溶性多糖對DPPH的清除率高于茯苓總酸性多糖，但分級提取的酸性多糖組分PSAP1、PSAP8、PSAP9對DPPH的清除率高于PWP。

2.3 茯苓多糖對羥基自由基清除率

羥基自由基可與任何大分子物質(zhì)反應(yīng)，導(dǎo)致機體受損和基因突變，引起機體衰老和其他病癥。采用1.3.4所述方法分別測定茯苓多糖各供試樣品（PWP、PAP、PSAP1→PSAP10）對羥基自由基的清除作用，并進行比較，結(jié)果如圖3所示。

圖3 茯苓多糖羥基自由基清除率Fig.3 Thescavenging activity on hyd roxyl radical ridical of polysaccharide from Poria cocos

由圖3可見，茯苓多糖各供試樣品均對羥自由基具有清除作用，其中茯苓水溶性多糖對羥自由基的清除率高于茯苓總酸性多糖，但分級提取的酸性多糖組分PSAP8、PSAP9對羥自由基的清除率均高于PWP。

3 結(jié)論與展望

本論文研究表明，茯苓多糖具有顯著性抗氧化活性。由于抗氧化作用與人類健康密切相關(guān)，茯苓作為藥食兩用傳統(tǒng)中藥大品種，應(yīng)用歷史悠久，在防治疾病和養(yǎng)生保健方面享有盛譽。宋代文學(xué)家蘇東坡描述茯苓餅的制作與功效：“以酒蒸胡麻，用去皮茯苓少入白蜜為餅食之，日久氣力不衰，百病自去，此乃長生要訣”；相傳成吉思汗在中原作戰(zhàn)患風(fēng)濕病，服食茯苓治愈；慈禧太后常食茯苓餅，享年74歲（1834-1908）[4]。因此，本論文詮釋了茯苓多糖為茯苓藥材抗氧化的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從而為該藥食兩用中藥的臨床療效和保健強身功能提供了科學(xué)依據(jù)。

茯苓多糖主要是酸性多糖，其含量為茯苓總多糖90%以上。本論文采用0.1mol/L~1.0mol/L梯度NaOH溶液分級提取茯苓酸性多糖，得到10種酸性多糖組分，并對其進行了抗氧化作用比較研究。研究結(jié)果表明，10種茯苓酸性多糖組分均具有不同程度的抗氧化作用，但各組分酸性多糖抗氧化作用差異明顯，其中PSAP8和PSAP9兩種酸性多糖組分抗氧化作用優(yōu)于其他組分。綜合分析，茯苓酸性多糖抗氧化作用與其酸性強弱具有相關(guān)性。

迄今為止，有關(guān)茯苓多糖的研究報道，主要是茯苓多糖通過降解和羧甲基化的研究與開發(fā)，直接應(yīng)用茯苓多糖進行藥效學(xué)及其保健功能研究鮮見報道。本實驗室前期對茯苓水溶性多糖和酸性多糖進行了調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤及阿霉素致腎病大鼠模型的藥效學(xué)進行了研究，藥理效果明顯。本論文采用溶劑法和不同濃度NaOH溶液梯度分級提取方法，將茯苓多糖提取分離為水溶性多糖和酸性多糖及10種分級分離的酸性多糖組分；抗氧化試驗研究表明，水溶性多糖和酸性多糖均具有明顯抗氧化作用，不同濃度NaOH溶液分級提取酸性多糖組分的抗氧化活性與其酸性強弱有關(guān)。茯苓多糖不經(jīng)過降解和羧甲基化反應(yīng)，直接開發(fā)利用可簡化工藝，減低成本。因此，本論文研究結(jié)果進一步為直接開發(fā)利用茯苓多糖提供了實驗依據(jù)。

本論文后續(xù)研究擬對茯苓酸性多糖的分子量、單糖組成和連接方式進行深入研究，探討其構(gòu)效關(guān)系，并進行抗氧化作用機理研究，以期為茯苓多糖的開發(fā)應(yīng)用提供更充分的參考。

[1]祝子坪,李娜.桑黃菌多糖體外抗氧化作用[J].食品科學(xué),2011,32 (19):92-95

[2]曹宇,高文遠,張黎明,等.羧甲基茯苓多糖的抗氧化研究[J].食品研究與開發(fā),2009,30(11):148-151

[3]王曦,羅霞,許曉燕,等.不同乳酸菌菌株抗氧化能力的比較研究[J].食品科學(xué),2010,31(9):197-201

[4]於小波,昝俊峰,王金波,等.我國茯苓藥材主要產(chǎn)區(qū)資源調(diào)查[J].時珍國醫(yī)國藥,2011,22(3):714-716

Study on Antrioxidant Properies of Polysaccharides from Poria cocos

LUHua-jie，LUYan，LIUYan-wen*

（Pharmacy College，Hubei University of Chinese Medicine，Provincial Key Laboratory of Resource and Chemistry of Chinese Medicine，Wuhan 430061，Hubei，China）

In order to provide the theoretical evidences for developing polysaccharides from Poria cocas，antioxidant properties of water-solubillity polysaccharides，acidic polysaccharides and polysaccharides in differentacidicity were compared in this paper.The Poria cocoswater-solubillity polysaccharides（PWP）and Poria cocosacidic polysaccharides（PAP）wereextracted respectivelybywaterand 1mol/LNaOH solution.10 of Poria cocosseparaateacidic polysaccharides（PSAP）componentswereextracted and seperated from the drey of the decoction of PWP by a gradient elution program with 0.1 mol/L-1.0 mol/L NaOH soulutions.The reducing power，DPPH scaveage rate and·OH scaveage rate were used to compare the antioxidant of PWP，PAP and 10 PSAPs.The resultdemonstrated thatboth PWP，PAPhad antioxidanteffectand 10PSAPshad antioxidation in differentdegreas，and PSAP8 and PSAP9were better than others.With comprehensive analysis，polycharrides in poriahavegood antioxidationand theantioxidationofpap is relevantto itsaciditystrength.

Poria cocospolysaccharides；acidic polysaccharides；gradientextraction；antioxidant

2014-04-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.23.001

“十二五”國家科技支撐計劃的子課題（2010BAE00386）

盧華杰（1986—），男（漢），在讀碩士研究生，研究方向：中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

*通信作者：劉焱文（1945—），男（漢），教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究。