武愛玲 趙新杰

(1 河南省洛陽正骨醫(yī)院，洛陽，471002； 2 河南省洛正制藥廠，洛陽，471013)

中藥研究

HPLC-ELSD測定黃芪生絡(luò)復(fù)康丸中黃芪甲苷的含量

武愛玲1趙新杰2

(1 河南省洛陽正骨醫(yī)院，洛陽，471002； 2 河南省洛正制藥廠，洛陽，471013)

目的：采用HPLC-ELSD法建立黃芪生絡(luò)復(fù)康丸中黃芪甲苷的含量測定方法。方法：色譜柱為Diamonsic C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(35∶65)為流動相，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為40 ℃。ELSD檢測器，霧化器溫度80 ℃，蒸發(fā)器溫度100 ℃，載氣流速1.5 mL·min-1。結(jié)果：黃芪甲苷進(jìn)樣量在1.62～8.10 μg時(shí)線性關(guān)系良好，r=0.999 9，平均加樣回收率為99.08%(RSD=1.63%)。結(jié)論：本方法簡便、準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可用于本品的質(zhì)量控制。

HPLC-ELSD；黃芪生絡(luò)復(fù)康丸；黃芪甲苷；含量測定

黃芪生絡(luò)復(fù)康丸是本院的內(nèi)部制劑，由黃芪、淫羊藿、丹參、赤芍、川芎、桃仁等藥組成，具有補(bǔ)氣益腎生髓，活血化瘀生絡(luò)的作用，用于不完全性周圍神經(jīng)損傷及周圍神經(jīng)變性。原標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法對黃芪甲苷進(jìn)行含量測定[1]，因薄層掃描法含量測定重現(xiàn)性較低，操作繁瑣，測定周期長。為了更有效地控制其產(chǎn)品質(zhì)量，本文應(yīng)用高效液相色譜法測定黃芪生絡(luò)復(fù)康丸中黃芪甲苷的含量，并對其進(jìn)行方法學(xué)考察。結(jié)果表明，該法簡便快速，結(jié)果準(zhǔn)確。

1 儀器與試藥

shimadzu LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)，LC Workstation，配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、柱溫箱、自動進(jìn)樣器；ELSD-2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器(美國Alltech公司)。AB135-S型梅特勒拖利多電子天平，METTLER AE200電子分析天平。黃芪甲苷對照品(批號：110781-200613)購自中國藥品生物制品檢定所。試劑均為分析純。六批樣品均由河南省洛陽正骨醫(yī)院制劑科生產(chǎn)并提供。

2 方法與結(jié)果[2-13]

2.1 色譜條件 Diamonsic C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈-水(35∶65)為流動相進(jìn)行洗脫，流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；ELSD檢測器，霧化器溫度80 ℃，蒸發(fā)器溫度100 ℃，載氣流速1.5 mL·min-1。色譜柱的理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)不低于3 000。進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 在選定條件下，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，且與其他相鄰色譜峰分離度大于1.5。理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計(jì)在3 000以上，而陰性對照在此保留時(shí)間無干擾(見圖1)。

2.3 對照品溶液的制備 精密稱取在60 ℃真空干燥4 h的黃芪甲苷對照品適量，用甲醇溶解，制成每1 mL含黃芪甲苷700 μg的溶液作為對照品1，吸取對照品1溶液適量，甲醇稀釋制成每1 mL含黃芪甲苷260 μg的溶液作為對照品2，即得。

圖1 黃芪生絡(luò)復(fù)康丸HPLC圖譜

注：A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.黃芪甲苷

2.4 陰性對照液的制備 取缺黃芪的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，制得陰性對照液。

2.5 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，取約5 g，精密稱定，加水10 mL，微熱溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，水飽和正丁醇40 mL，萃取4次，合并正丁醇層，再取氨試液40 mL，萃取2次，棄去氨水層。減壓濃縮回收正丁醇至干，殘?jiān)眉状既芙舛ㄈ萦?0 mL，搖勻，即得。

2.6 線性關(guān)系考察 精密稱取黃芪甲苷對照品1 620 mg，置10 mL的棕色量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻。精密吸取2.5，2.0，1.5，1.0，0.5 mL置5 mL的量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10 μL進(jìn)樣，測定其峰面積，以黃芪甲苷進(jìn)樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析，得黃芪甲苷的回歸方程Y=0.998 7X+6.640 7，r=0.999 9，線性范圍為1.62～8.10 μg。

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對照品2溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)行5次，測定黃芪甲苷峰面積積分值。結(jié)果其相對標(biāo)準(zhǔn)差RSD為1.56%。

2.8 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批號供試品，按“2.5”項(xiàng)下方法制成供試品溶液5份，分別進(jìn)樣10 μL，測定黃芪甲苷峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.38%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份供試品溶液10 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12 h時(shí)進(jìn)樣，測定黃芪甲苷峰面積積分值。結(jié)果RSD為1.67%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測定含量的黃芪生絡(luò)復(fù)康丸細(xì)粉(批號：120601)2.5 g，共6份，各加入黃芪甲苷濃度為1.402 mg/mL的混合對照液2 mL，分別用與“2.5”項(xiàng)下方法制得供試品溶液，各進(jìn)樣10 μL，進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

2.11 樣品測定 取6個(gè)批號的樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，分別精密吸取兩個(gè)濃度的對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算，即得。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=2)

3 討論

黃芪甲苷含量測定方法較多，主要有高效液相色譜法、薄層掃描法、比色法、熒光法等幾大類方法[14]。但大多數(shù)制劑由于成分復(fù)雜，干擾嚴(yán)重；近年來，隨著新型檢測器ELSD的出現(xiàn)，使原本無紫外吸收的黃芪甲苷也得以很好的分離，HPLC法因操作簡單、快速、靈敏度高、重現(xiàn)性好而優(yōu)于其他方法。

黃芪生絡(luò)復(fù)康丸是本院的內(nèi)部制劑，原標(biāo)準(zhǔn)中采用薄層掃描法對黃芪甲苷進(jìn)行含量測定，工作中經(jīng)常出現(xiàn)展開系統(tǒng)不穩(wěn)定，分離效果欠佳的情況，另因薄層掃描法含量測定重現(xiàn)性較低，操作繁瑣，測定周期長。故本方法采用了ELSD-HPLC法。

樣品處理方法文獻(xiàn)上有索氏提取脫酯后萃取法、超聲提取后萃取法、大孔樹脂提取法、KOH回流提取法、中性氧化鋁柱法[15-16]。本研究分別比較了溶劑兩相萃取、大孔吸附樹脂和中性氧化鋁柱3種方法。結(jié)果表明，大孔吸附樹脂法在洗脫過程中易產(chǎn)生氣泡，且保留率較低。中性氧化鋁柱可吸附大部分水溶性及脂溶性雜質(zhì)，能有效除去樣品溶液中較多雜質(zhì)，但操作繁瑣。而溶劑萃取法操作簡便，且能除去大部分雜質(zhì)，使樣品溶液得到較好的精制效果。故選用溶劑萃取法。

流動相的選擇，考察了5種展開系統(tǒng)對黃芪生絡(luò)復(fù)康丸中黃芪甲苷的分離及含量測定的影響。曾采用甲醇-水(80∶20)、甲醇-水(75∶25)、乙腈-水(30∶70)、乙腈-水(32∶68)、乙腈-水(35∶65)等不同流動相，結(jié)果測定流動相為乙腈-水(35∶65)時(shí)黃芪甲苷峰形良好，可達(dá)到基線分離，與相鄰峰分離度較好。本試驗(yàn)也對柱溫條件進(jìn)行了考察，結(jié)果表明柱溫在40 ℃時(shí)峰形較好。

ELSD檢測器參數(shù)的確定：經(jīng)多次試驗(yàn)，并按ELSD檢測器設(shè)置要求，確定了霧化器溫度80 ℃，蒸發(fā)器溫度100 ℃，載氣流速1.5 mL·min-1。因?yàn)闇囟冗^高或過低直接影響溶劑的揮發(fā)程度，進(jìn)而影響基線的穩(wěn)定性。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，加樣回收率高，可用于黃芪生絡(luò)復(fù)康丸的含量測定。

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(2013-05-29收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

HPLC-ELSD Determination of Astragaloside in Huangqi Shengluo Fukang Pill

Wu Ailing1， Zhao Xinjie2

(1HenanLuoyangOrthopedic-TraumatologicalHospital，Luoyang471002，China; 2HenanLuozhengPharmaceuticalFactory，Luoyang471013，China)

Objective： To establish a content determination method of Astragaloside in Huangqi Shengluo Fukang Pill by HPLC-ELSD.Methods： The chromatographic Column Diamonsic C18(4.6mm×250mm，5μm)was set. The mobile phase consisted of acetonitrile and water (35：65)， and the flow rate was 1.0mL·min-1. The column temperature was 40℃，and the content was determined with evaporate light scattering detector (ELSD). The temperature of spray chamber was 80℃ and the temperature of evaporator was 100℃.The gas flow rate of parameter of ELSD was 1.5mL·min-1.Results： The linear range of Astragaloside was within 1.62 to 8.10μg (r=0.9999).The average recovery rate was 99.08%(RSD=1.63%. Conclusion： The established method is convenient and accurate and highly specific， and it can be used for the quality control of Huangqi Shengluo Fukang Pill.

HPLC-ELSD; Huangqi Shengluo Fukang Pill; Astragaloside; Determination

武愛玲(1978—)，女，河南省洛陽正骨醫(yī)院，主管藥師，碩士，主要從事醫(yī)院制劑開發(fā)與研究工作

趙新杰(1972—)，男，河南省洛正制藥廠，副研究員，地址：河南省洛陽市白馬寺車站路北1號河南省洛正制藥廠，E-mail：wal2317@163.com

R286.0

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.05.031