練杭蕓，徐王彥君，梁乾德，馬增春, 王宇光,湯響林, 譚洪玲, 肖成榮， 高 月

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所，北京 100850)

UPLC-QTOF MS法比較赤芍、白芍煎液化學(xué)成分差異

練杭蕓1，徐王彥君1，梁乾德2，馬增春2, 王宇光2,湯響林2, 譚洪玲2, 肖成榮2， 高 月2

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽 合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所，北京 100850)

為了解中藥赤芍和白芍煎液的化學(xué)成分差異，采用UPLC-QTOF MS技術(shù)對(duì)市場上正規(guī)銷售的赤芍和白芍飲片樣品進(jìn)行分析比較，并用主成分分析和正交偏最小二乘辨別分析進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，同時(shí)采用與標(biāo)準(zhǔn)品比較、基于自制自動(dòng)化預(yù)鑒別軟件的一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比分析和二級(jí)質(zhì)譜碎片分析進(jìn)行成分鑒別。結(jié)果表明，氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別是赤芍和白芍煎液最重要的差異性化合物。此外，赤芍藥苷、1’-O-benzoylsucrose、牡丹皮苷F、牡丹皮苷C/苯甲酰羥基芍藥苷、牡丹皮苷E、(1S,2S,4R)-trans-2-hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside、蔗糖、沒食子酰芍藥苷/沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷等在赤芍、白芍煎液中的含量差異明顯。

LC/MS; 赤芍; 白芍; 煎液; 化學(xué)成分

常用中藥赤芍、白芍的基源和藥性相似，但臨床用途明顯不同[1]。雖然古代醫(yī)家有“白補(bǔ)而赤瀉，白收而赤散”[2]的說法，但現(xiàn)代研究對(duì)于兩藥的藥理作用差異尚未給出明確的結(jié)論，有些研究結(jié)果甚至相反[3-9]，顯然通過比較藥理作用而揭示兩藥差異還需要深入研究。任何藥理作用總有其物質(zhì)基礎(chǔ)，兩藥間的一種或幾種差異的化學(xué)成分很可能就是兩藥藥理作用差異的決定因素。因此，通過比較西藥的化學(xué)成分差異，在一定程度上可對(duì)了解其藥理差異給出有益的提示。但比較兩種中藥的化學(xué)成分差異并非易事。目前，探索赤芍、白芍化學(xué)成分差異多采用比較基于紫外檢測器的色譜指紋圖譜，再以數(shù)量有限的幾種標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行峰的指認(rèn)技術(shù)[10-14]。受分辨能力、標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量等限制，該方法所獲得的信息較少。最近，南京中醫(yī)藥大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)率先將超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF MS)技術(shù)運(yùn)用于這個(gè)領(lǐng)域[15]。超高效液相色譜和高分辨質(zhì)譜相結(jié)合可以使不同化學(xué)成分更好地相互區(qū)分，并且檢測到的精確質(zhì)荷比數(shù)據(jù)使得在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下也能獲得關(guān)于化合物結(jié)構(gòu)的重要提示，因此獲得的信息較傳統(tǒng)方法更豐富。本研究擬采用UPLC-QTOF MS技術(shù)研究赤芍、白芍的化學(xué)成分差異，與上述研究團(tuán)隊(duì)不同的是樣品均來自北京市場，考察對(duì)象是兩藥的煎液(考慮到臨床用藥以水煎為主，樣品制備采用飲片水煎后乙醇沉淀)。另外，除了與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行成分鑒別外，同時(shí)使用本實(shí)驗(yàn)室自制的自動(dòng)化預(yù)鑒別軟件進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比數(shù)據(jù)鑒別，以多種可能的離子形態(tài)進(jìn)行自動(dòng)化結(jié)構(gòu)預(yù)判，并進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜碎片分析以提高鑒別結(jié)果的可信度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥材和試劑

赤芍、白芍飲片：隨機(jī)購自北京6家正規(guī)藥店；芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品：購自中國藥品生物制品檢定所；蔗糖(分析純)：西隴化工股份有限公司產(chǎn)品；甲酸(HPLC級(jí))：德國CNW Technologies GmbH公司產(chǎn)品；乙腈(HPLC級(jí))：美國Fisher Scienific公司產(chǎn)品；超純水由Millipore超純水系統(tǒng)制備。

1.2 樣品制備

精密稱取20 g白芍或赤芍飲片，第一煎加160 mL水，浸泡1 h后煎30 min，過濾，第二煎加100 mL水，煎20 min，過濾，合并兩煎煎液。加水至200 mL，混勻后取20 mL逐滴加入至80 mL乙醇中，減壓抽濾，濾液在低于50 ℃下減壓濃縮至1 mL左右，用50%乙腈溶液轉(zhuǎn)移并定容至25 mL容量瓶中。芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品以50%乙腈溶液溶解。樣品溶液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣分析。

1.3 UPLC-QTOF MS條件

1.3.1 色譜條件 樣品分析使用Acquity UPLC與Synapt HD-QTOF-MS聯(lián)用系統(tǒng)。Waters Acquity HSS T3 色譜柱(100 mm × 2.1 mm ×1.8 μm)，配備Vanguard HSS T3保護(hù)柱；柱溫30 ℃；梯度洗脫溶劑：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為含0.1%甲酸的乙腈溶液；洗脫過程：2%B(0～1 min)，2%～5%B(1～2 min)，5%～12%B(2～5 min)，12%～20%B(5～10 min)，20%～30% B10～12 min)，30%～50%B(12～13 min)，50%～100%B(13～15 min)，100%B(15～16 min)；流速0.5 mL/min；進(jìn)樣量2 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離(ESI)離子源，V模式檢測，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1 500，毛細(xì)管電壓分別為3 kV(正離子模式)和2.9 kV(負(fù)離子模式)，樣品錐電壓40 V，提取錐電壓4 V，源溫100 ℃，脫溶劑氣溫度450 ℃，脫溶劑氣流速900 L/h，鎖校質(zhì)荷比(lock mass)分別為m/z556.277 1(正離子模式)和m/z554.261 5(負(fù)離子模式)。數(shù)據(jù)采集控制和分析軟件為MassLynx(V4.1)，包含MarkerLynx數(shù)據(jù)分析模塊。

1.4 主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘辨別分析(OPLS-DA)

用MassLynx軟件中的MarkerLynx模塊分別對(duì)全部樣品正離子和負(fù)離子模式的UPLC-QTOF MS原始數(shù)據(jù)進(jìn)行峰檢測、然后進(jìn)行PCA和OPLS-DA分析。其中強(qiáng)度閾值50，質(zhì)量窗口0.05，保留時(shí)間窗口0.2。PCA和OPLS-DA分析的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法為Pareto。

1.5 芍藥屬植物化學(xué)成分文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫

用CNKI和Medline等工具檢索芍藥屬植物化學(xué)成分的文獻(xiàn)。將化合物分子式、化學(xué)名稱等信息錄入Excel表，約200項(xiàng)。將每個(gè)化合物的分子式用本實(shí)驗(yàn)室自制軟件進(jìn)行元素拆解計(jì)數(shù)，計(jì)算出正離子模式下常見離子[M+H]+、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+、[2M+H]+、[2M+H+K]2+和負(fù)離子模式下常見離子[M-H]-、[M+HCOO]-、[2M-H]-、[M+Cl]-，共計(jì)10種離子形態(tài)的精確質(zhì)荷比數(shù)值，從而建立可用于自動(dòng)化預(yù)鑒別的芍藥屬植物化學(xué)成分文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫。

1.6 Marker的鑒別

將芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品、芍藥內(nèi)酯苷、蔗糖溶液在相同分析條件下獲得的數(shù)據(jù)與待鑒別Marker數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(包括保留時(shí)間和質(zhì)譜特征)，以確定Marker中是否含有這些化合物。將待鑒別Marker的保留時(shí)間和質(zhì)荷比數(shù)據(jù)與上述數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)拷貝于同一Excel表。用本實(shí)驗(yàn)室自制的Searcher軟件進(jìn)行批量自動(dòng)化預(yù)鑒別，實(shí)測數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)的質(zhì)荷比偏差不大于10-5，即認(rèn)定為相匹配。對(duì)全部待鑒別Marker進(jìn)行MS/MS分析，根據(jù)碎片離子質(zhì)荷比信息，對(duì)預(yù)鑒別提示的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.7 重要Marker信號(hào)強(qiáng)度比較

2 結(jié)果與討論

2.1 典型色譜圖

赤芍和白芍樣品在正離子和負(fù)離子模式下的UPLC-QTOF MS基峰強(qiáng)度離子流圖(BPI)示于圖1。

注：a.赤芍(正離子譜)；b.白芍(正離子譜)；c.赤芍(負(fù)離子譜)；d.白芍(負(fù)離子譜)圖1 赤芍和白芍樣品的典型UPLC-QTOF MS基峰強(qiáng)度離子流(BPI)色譜圖Fig.1 Typical UPLC-QTOF MS base peak intensity(BPI) chromatogram of Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba samples

2.2 PCA分析

赤芍和白芍樣品在正離子和負(fù)離子模式下的UPLC-QTOF MS數(shù)據(jù)PCA分析的得分圖示于圖2a和2b。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣品，橫、縱坐標(biāo)分別為第一、第二主成分得分?？梢钥闯觯瑹o論是正離子模式還是負(fù)離子模式，赤芍和白芍樣品均在第一主成分得分上有明顯差異，即分別聚向橫軸的相反方向，表明二者UPLC-QTOF MS數(shù)據(jù)的差異特征明顯。

2.3 OPLS-DA分析

赤芍和白芍樣品在正離子和負(fù)離子模式條件下的UPLC-QTOF MS數(shù)據(jù)OPLS-DA分析的S圖示于圖2c和2d。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)變量，即位于某個(gè)保留時(shí)間的某個(gè)質(zhì)荷比的信號(hào)強(qiáng)度。橫坐標(biāo)代表變量的貢獻(xiàn)度(協(xié)方差)，縱坐標(biāo)代表變量的相關(guān)性(可信度)，在-1～1之間取值[16]。無論是橫坐標(biāo)還是縱坐標(biāo)，正方向代表赤芍組信號(hào)強(qiáng)于白芍組，負(fù)方向代表白芍組信號(hào)強(qiáng)于赤芍組。越靠近S形點(diǎn)集兩端的點(diǎn)，其信號(hào)強(qiáng)度在兩組間有差異的特征越明顯。圖中紅色方框所標(biāo)記的點(diǎn)是以“橫坐標(biāo)絕對(duì)值> 0.001，縱坐標(biāo)絕對(duì)值> 0.8”為標(biāo)準(zhǔn)選擇出的差異性信號(hào)，共107個(gè)，其中正離子模式67個(gè)，負(fù)離子模式40個(gè)。

注：a.正離子PCA得分圖；b.負(fù)離子PCA得分圖；▲為赤芍樣品，■為白芍樣品； c.正離子OPLS-DA的S圖；d.負(fù)離子OPLS-DA的S圖；紅色方框所標(biāo)記的點(diǎn)是選擇出的差異性信號(hào)圖2 赤芍和白芍樣品UPLC-QTOF MS的PCA得分圖和OPLS-DA的S圖Fig.2 Score plot from PCA and S-Plot from OPLS-DA of Radix Paeoniae Rubra and Radix Paeoniae Alba samples

2.4 鑒別

對(duì)Marker的鑒別包括與標(biāo)準(zhǔn)品比較、一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比與文獻(xiàn)化合物數(shù)據(jù)庫比較、二級(jí)質(zhì)譜碎片分析三方面。共考察了芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷和蔗糖3種標(biāo)準(zhǔn)品。一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比的比較采用本實(shí)驗(yàn)室自主研制的自動(dòng)化預(yù)鑒別(結(jié)構(gòu)預(yù)判)軟件[17]，這是因?yàn)檫@種預(yù)鑒別的工作量極大，具體表現(xiàn)在3個(gè)方面：1)電噴霧離子化過程中的化合物會(huì)形成多種形態(tài)的離子。除可能形成準(zhǔn)分子離子([M+H]+、[M-H]-)外，通常還會(huì)形成加合物離子和聚合物離子(如[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+K]+、[2M+H]+、[2M+H+K]2+、[M+HCOO]-、[2M-H]-、[M+Cl]-等)，以及源內(nèi)裂解碎片離子。因此，必須將質(zhì)譜信號(hào)假定為多種可能的離子形態(tài)(碎片離子除外)，推算出多種可能的精確分子質(zhì)量，并分別與數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，才能較好地減少預(yù)鑒別的錯(cuò)誤和遺漏。2)數(shù)據(jù)庫化合物的數(shù)量巨大，本研究所建立的芍藥屬植物化學(xué)成分文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫收集的化合物數(shù)量約200種。3)樣品中待鑒別數(shù)據(jù)量大，本研究的待鑒別Marker達(dá)107個(gè)。由此可見，依據(jù)一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)判的工作量極大，人工完成的難度很大，有必要借助計(jì)算機(jī)來自動(dòng)化完成。在沒有標(biāo)準(zhǔn)品的情況下，化合物二級(jí)質(zhì)譜碎片信息可以在一定程度上驗(yàn)證一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比的結(jié)構(gòu)預(yù)判結(jié)果，提高鑒別結(jié)果的可信度。一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比的比較和二級(jí)質(zhì)譜碎片分析的結(jié)果列于表1。

與Marker鑒別有關(guān)的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式示于圖3。

目前，“功能性食品”課程的主要教學(xué)單元包括：功能性食品基礎(chǔ)篇；氨基酸、活性肽、活性蛋白質(zhì)及其加工技術(shù)篇；功能性碳水化合物及其加工技術(shù)篇；活性油脂及其加工技術(shù)篇；其他功能性物質(zhì)及其加工技術(shù)篇和強(qiáng)化食品及其加工技術(shù)篇6個(gè)方面，目前課程的授課方式是先進(jìn)行理論講解，然后進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)實(shí)訓(xùn)。在理論講解的授課過程中，與實(shí)際生活不夠貼切，學(xué)生提不起學(xué)習(xí)興趣，有些知識(shí)點(diǎn)達(dá)不到良好的教學(xué)效果。

圖3 與Marker鑒別有關(guān)的化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.3 Chemical structures involved in Marker identification

2.4.1 芍藥苷(paeoniflorin) 全部選出的Marker中沒有與芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(7.48 min)一致的信號(hào)，表明芍藥苷在赤芍、白芍兩組間的含量差異并不明顯。

2.4.2 芍藥內(nèi)酯苷(albiflorin) 芍藥內(nèi)酯苷[18]標(biāo)準(zhǔn)品在6.9 min和11.2 min各有一個(gè)色譜峰，前者峰高約是后者的2～3倍，2個(gè)色譜峰的一級(jí)質(zhì)譜和主要離子的二級(jí)質(zhì)譜均非常相似(圖譜略)，因此可能是結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體，但也不排除生成了復(fù)合物的可能。在所選出的Marker中，這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)也都有符合芍藥內(nèi)酯苷特征的信號(hào)。這里將對(duì)應(yīng)的化合物分別稱為“芍藥內(nèi)酯苷1”和“芍藥內(nèi)酯苷2”。其中保留時(shí)間為6.9 min的芍藥內(nèi)酯苷1有信號(hào)67、100、103、106、107，保留時(shí)間為11.2 min的芍藥內(nèi)酯苷2有信號(hào)51、66。所有一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度都是白芍組高于赤芍組，表明芍藥內(nèi)酯苷含量高是白芍煎液區(qū)別于赤芍煎液的重要特征。

2.4.3 氧化芍藥苷(oxypaeoniflorin)或其異構(gòu)體 文獻(xiàn)報(bào)道的氧化芍藥苷[18]異構(gòu)體有2種。在5.5 min和7.9 min均出現(xiàn)了質(zhì)荷比與氧化芍藥苷一致的信號(hào)，前者峰高約是后者的5倍。這里將對(duì)應(yīng)的化合物分別稱為“氧化芍藥苷1”和“氧化芍藥苷2”。兩者的二級(jí)質(zhì)譜相似，可能是結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體。保留時(shí)間為5.5 min的氧化芍藥苷1有信號(hào)1、25、68、87，保留時(shí)間為7.9 min的氧化芍藥苷2有信號(hào)83。所有一級(jí)質(zhì)譜信號(hào)的強(qiáng)度都是赤芍組高于白芍組，說明赤芍煎液的氧化芍藥苷含量高于白芍煎液。

2.4.4 蔗糖(sucrose)或其異構(gòu)體 信號(hào)35(保留時(shí)間為0.55 min)與蔗糖的[M+K]+匹配，保留時(shí)間與蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品(保留時(shí)間為0.58 min)一致，赤芍組的信號(hào)強(qiáng)度高于白芍組，說明赤芍煎液的蔗糖含量高于白芍煎液。

2.4.5 赤芍藥苷(8-debenzoylpaeoniflorin)或其異構(gòu)體 信號(hào)2和11均與赤芍藥苷[19]的[M+Na]+匹配。這里將對(duì)應(yīng)的化合物分別稱為“赤芍藥苷1”和“赤芍藥苷2”。二者可能是結(jié)構(gòu)相似的異構(gòu)體。信號(hào)強(qiáng)度均為赤芍組高于白芍組，說明赤芍煎液中赤芍藥苷含量高于白芍煎液。

2.4.6 牡丹皮苷F(mudanpioside F)或其異構(gòu)體 信號(hào)8與牡丹皮苷F[20]的[M+Na]+匹配，赤芍組強(qiáng)度高于白芍組，說明赤芍煎液中牡丹皮苷F含量高于白芍煎液。

2.4.7 牡丹皮苷E(mudanpioside E)或其異構(gòu)體

信號(hào)32和93分別與牡丹皮苷E[20]的[M+Na]+和[M-H]-匹配，強(qiáng)度均為赤芍組高于白芍組，說明赤芍煎液中牡丹皮苷E含量高于白芍煎液。

2.4.8 1’-O-benzoylsucrose或其異構(gòu)體和未知化合物1 信號(hào)4和59均與1’-O-benzoylsucrose[21]的[M+Na]+匹配。信號(hào)4的MS/MS顯示存在單糖結(jié)構(gòu)，而信號(hào)59的MS/MS不支持存在單糖結(jié)構(gòu)，這里稱為“未知化合物1”。赤芍組的信號(hào)4強(qiáng)度高于白芍組，而信號(hào)59的強(qiáng)度則相反，說明赤芍煎液中1’-O-benzoylsucrose含量高于白芍煎液，而未知化合物1在白芍煎液中的含量高于赤芍煎液。

2.4.9 (1S,2S,4R)-trans-2-Hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside或其異構(gòu)體 信號(hào)34與(1S,2S,4R)-trans-2-Hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside[22]的[M+Na]+匹配，赤芍組強(qiáng)度高于白芍組，說明赤芍煎液中該化合物含量高于白芍煎液。

2.4.10 沒食子酰芍藥苷(galloylpaeoniflorin)/沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷(galloylalbiflorin)或其異構(gòu)體 信號(hào)56與沒食子酰芍藥苷/沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷[23]的[M+Na]+匹配，白芍組強(qiáng)度高于赤芍組，說明白芍煎液中沒食子酰芍藥苷或沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷含量高于赤芍煎液。

2.4.11 牡丹皮苷C(mudanpioside C)/苯甲酰羥基芍藥苷(benzoyloxypaeoniflorin)或其異構(gòu)體 牡丹皮苷C[20]和苯甲酰羥基芍藥苷[24]互為異構(gòu)體。信號(hào)24和80分別與其[M+Na]+和[M-H]-匹配，強(qiáng)度均為赤芍組高于白芍組，說明赤芍煎液中牡丹皮苷C或苯甲酰羥基芍藥苷含量高于白芍煎液。

2.4.12 未知化合物2 信號(hào)33和95分別與分子式為C31H34O14的化合物[M+Na]+和[M-H]-匹配。數(shù)據(jù)庫中，6'-O-benzoyl-4''-hydroxy-3"-methoxy-paeoniflorin[25]和牡丹皮苷B(mudanpioside B)[20]與此分子式相符，但信號(hào)95的MS/MS碎片信息均不支持，因此這里稱為“未知化合物2”。信號(hào)強(qiáng)度均為赤芍組高于白芍組，表明赤芍煎液中該化合物含量高于白芍煎液。

2.5 差異化合物的貢獻(xiàn)度排序

在OPLS-DA的S圖中，其橫坐標(biāo)的絕對(duì)值顯示了變量(信號(hào))對(duì)模型的貢獻(xiàn)度大小[16]。絕對(duì)值越大，貢獻(xiàn)度越大。正方向代表赤芍組信號(hào)強(qiáng)度高于白芍組，負(fù)方向反之。因此，為了探討各個(gè)被鑒別化合物的重要性大小，將它們的對(duì)應(yīng)Marker按照橫坐標(biāo)數(shù)值進(jìn)行排序。信號(hào)強(qiáng)度為赤芍組高于白芍組的化合物：氧化芍藥苷1>赤芍藥苷1>1-O-benzoylsucrose>牡丹皮苷F>赤芍藥苷2>牡丹皮苷C/苯甲酰羥基芍藥苷> 氧化芍藥苷2>牡丹皮苷E>未知化合物2>(1S,2S,4R)-trans-2-Hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside > 蔗糖；信號(hào)強(qiáng)度為白芍組高于赤芍組的化合物：芍藥內(nèi)酯苷1>芍藥內(nèi)酯苷2>未知化合物1>沒食子酰芍藥苷/沒食子酰芍藥內(nèi)酯苷。可以看出，“赤芍組含量高于白芍組”的特征所涉及的化合物較多，而“白芍組含量高于赤芍組”的化合物相對(duì)較少，這可能與白芍藥材在“煮和去皮”等加工過程中有多種化學(xué)成分流失有一定關(guān)系。氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別是赤芍組和白芍組最重要的差異性化合物，二者信號(hào)強(qiáng)度的比較示于圖4。

在文獻(xiàn)[15]中也發(fā)現(xiàn)氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別在赤芍和白芍中含量高，這與本研究的結(jié)果一致。但其報(bào)道中提到二者并不是貢獻(xiàn)度最大的，這可能與藥材的產(chǎn)地以及分析過程中樣品的前處理方法不同等因素有關(guān)。同樣，文獻(xiàn)[11]也發(fā)現(xiàn)白芍中芍藥內(nèi)酯苷峰的面積遠(yuǎn)高于赤芍。

2.6 藥理學(xué)意義

關(guān)于赤芍、白芍中單體化學(xué)成分的藥理學(xué)研究還較少。本研究發(fā)現(xiàn)，氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別是赤芍和白芍煎液中最重要的差異化學(xué)成分，因此比較其藥理作用有助于發(fā)現(xiàn)赤芍和白芍的功效差異。從已有的研究報(bào)道[26-33]分析，芍藥內(nèi)酯苷對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用(抗驚厥、鎮(zhèn)痛)較明確，氧化芍藥苷的抗炎作用較明確。那么，白芍的某些功效特點(diǎn)，如“柔肝止痛”，會(huì)不會(huì)與芍藥內(nèi)酯苷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用有關(guān)？赤芍某些功效特點(diǎn)，如“清熱涼血”，會(huì)不會(huì)與氧化芍藥苷的抗炎作用有關(guān)？要回答上述猜測，以及最終闡明赤芍和白芍功效差異的本質(zhì)，還必須直接比較各差異性化合物的藥理作用。

圖4 氧化芍藥苷(a，b)和芍藥內(nèi)酯苷(c，d)的信號(hào)強(qiáng)度比較Fig.4 Comparison of signal intensities of oxypaeoniflorin (a，b)and albiflorin(c，d)

3 結(jié)論

氧化芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷分別是赤芍和白芍煎液最重要的差異性化合物。此外，赤芍藥苷、1’-O-benzoylsucrose、牡丹皮苷F、牡丹皮苷C/苯甲酰羥基芍藥苷、牡丹皮苷E、(1S,2S,4R)-trans-2-Hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside、蔗糖、沒食子酰芍藥苷/沒食子酰芍藥苷等在赤芍、白芍煎液中的含量差異明顯。這為探討赤芍、白芍化學(xué)成分及藥效差異提供了參考。

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Chemical Comparison Between Decoctions ofRadixPaeoniaeRubraandRadixPaeoniaeAlbaby UPLC-QTOF MS

LIAN Hang-yun1, XU Wang-yan-jun1, LIANG Qian-de2,MA Zeng-chun2, WANG Yu-guang2, TANG Xiang-lin2,TAN Hong-ling2, XIAO Cheng-rong2, GAO Yue2

(1.AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China；2.InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalScience,Beijing100850,China)

To investigate the chemical comparison between decoctions ofRadixPaeoniaeRubraandRadixPaeoniaeAlba, the samples from legal market were compared using ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-QTOF MS). Data were statistically analyzed by principal component analysis and orthogonal partial least-squares to latent structures discriminate analysis. The comparing with reference compounds, accuratem/zvalue analysis of TOF-MS data based on in-house software for automatic tentative identification and QTOF-MS/MS fragment analysis were applied to constituents identification. The results indicate that oxypaeoniflorin and albiflorin are the most important differential constituents in the decoctions ofRadixPaeoniaeRubraandRadixPaeoniaeAlba, respectively. Moreover, the contents of 8-debenzoylpaeoniflorin, 1’-O-benzoylsucrose, mudanpioside F, mudanpioside C/benzoloxypaeoniflorin, mudanpioside E, (1S,2S,4R)-trans-2-hydroxy-1,8-cineole-B-D-glucopyranoside, saccharose and galloylpaeoniflorin/galloylalbiflorin may also be of significant difference for two kinds of decoctions.

LC/MS;RadixPaeoniaeRubra;RadixPaeoniaeAlba; decoction; chemical comparison

2013-10-25；

2014-01-23

國家自然科學(xué)基金(81073161，81130067)資助

練杭蕓(1988～)，女(漢族)，浙江杭州人，碩士研究生，從事藥物分析、中藥現(xiàn)代化研究。E-mail:lianhangyun@sina.com

梁乾德(1971～)，男(漢族)，吉林農(nóng)安人，博士，從事藥物分析、中藥現(xiàn)代化研究。E-mail:liangqiande@yeah.net 高 月(1963～)，女(漢族)，江蘇宜興人，研究員，從事藥理毒理學(xué)、中藥現(xiàn)代化研究。E-mail:gaoyue@bmi.ac.cn

O 657.63

A

1004-2997(2014)03-0269-10

10.7538/zpxb.2014.35.03.0269