董曉峰,劉 林,王 姜,許 檸,顧海巍,周書民，陳煥文

(東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013)

電噴霧萃取電離源調(diào)節(jié)裝置的研制

董曉峰,劉 林,王 姜,許 檸,顧海巍,周書民，陳煥文

(東華理工大學(xué)，江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013)

電噴霧萃取電離(EESI)源具有樣品無需復(fù)雜預(yù)處理、易于集成和小型化、可與多種商用質(zhì)譜儀聯(lián)用、適于現(xiàn)場分析等特點，已在生命科學(xué)、環(huán)境、食品、國防、刑偵等領(lǐng)域的復(fù)雜基體樣品的直接質(zhì)譜分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。然而，實驗室制作的普通EESI源長期穩(wěn)定性較差，空間位置難以精確調(diào)節(jié)，針對此問題，本工作研制了EESI源的調(diào)節(jié)裝置。在優(yōu)化離子源空間位置參數(shù)與儀器參數(shù)的條件下，安裝該調(diào)節(jié)裝置后，采用EESI源對脯氨酸進行檢測，檢測限由0.5 μg/L降至0.075 μg/L，并對肺癌患者血樣中的纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺進行連續(xù)5日檢測，各樣品的平均RSD均小于10%。實驗證明，該調(diào)節(jié)裝置具有操作簡單、穩(wěn)定性高、適應(yīng)范圍廣等特點，對EESI離子源的性能有較大提高。

電噴霧萃取電離；調(diào)節(jié)裝置；表征；長期穩(wěn)定性

電噴霧萃取電離(extractive electrospray ionization，EESI)技術(shù)是在電噴霧電離(ESI)技術(shù)[1]和電噴霧解吸電離(DESI)技術(shù)[2]的基礎(chǔ)上，引進液-液微萃取技術(shù)[3-4]而發(fā)展起來的新興電離技術(shù)。與ESI直接電離經(jīng)過預(yù)處理的樣品不同，EESI首先電離的是純粹溶劑，樣品與電場或帶電粒子等不發(fā)生直接接觸，不受刺激性溶劑(如甲醇、乙酸等)的污染，且無需復(fù)雜繁瑣的樣品前處理過程，最大限度地保證樣品不受試劑和操作條件的影響，因而是一種比ESI更溫和的軟電離技術(shù)，可以直接分析原生態(tài)樣品。與DESI相比，EESI后續(xù)發(fā)展的中性解吸(neutral desorption)電噴霧萃取電離技術(shù)(ND-EESI)[5]可以使待測物的解吸過程和電離過程在空間和時間上分離，從而實現(xiàn)復(fù)雜樣品的遠程和實時在線檢測。因此，EESI適用于復(fù)雜基體樣品的直接質(zhì)譜分析，特別是在生物樣品分析、復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)體系的中間產(chǎn)物檢測、動植物的活體代謝組學(xué)分析等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，近年來受到廣泛的關(guān)注[6-13]。電噴霧萃取電離源是EESI質(zhì)譜分析的核心部分，主要由電噴霧通道和樣品通道構(gòu)成，實驗時需根據(jù)樣品的形態(tài)和待測物的性質(zhì)等對EESI源的各參數(shù)進行調(diào)節(jié)優(yōu)化，以達到最好的檢測效果。

EESI技術(shù)的原理示意圖[6]示于圖1。電噴霧通道中，萃取溶劑在高壓載氣(N2)的作用下被噴出并霧化，在高電壓作用下產(chǎn)生帶電的試劑離子，形成帶電的微小液滴；而在樣品通道中，樣品溶液在高壓載氣(N2)的作用下被噴出并霧化，形成微小的中性液滴。這2個獨立的噴霧通道產(chǎn)生的微小液滴在三維空間內(nèi)進行交叉碰撞，由于液-液微萃取作用，樣品中待測分子在兩相溶液中發(fā)生萃取轉(zhuǎn)移，從而使待測分子電離，該離子被引入到質(zhì)譜儀中即可進行質(zhì)量分析。由此可見，這2個噴霧通道的空間位置參數(shù)，即樣品通道與質(zhì)譜儀進樣口的角度α，樣品通道與質(zhì)譜儀進樣口的距離l，電噴霧通道與樣品通道之間的角度β，電噴霧通道與樣品通道之間的距離d，會直接影響待測分子的產(chǎn)生和傳輸過程，從而決定了質(zhì)譜信號的質(zhì)量[14-15]。然而，現(xiàn)有商用質(zhì)譜儀一般用ESI源進行質(zhì)譜分析，無法適用于EESI源的實驗；而實驗室普通的EESI源裝置一般由支撐棒、萬向桿架、不銹鋼三通管接頭拼裝的噴頭等組成，雖然易于搭建，但無法精確定量離子源空間位置參數(shù)，且穩(wěn)定性不高。因此，獲得一個穩(wěn)定的、可精確調(diào)控的EESI源，在直接質(zhì)譜分析中非常重要。

本工作擬研制一種EESI源的調(diào)節(jié)裝置，利用該裝置可精確定量調(diào)節(jié)離子源的空間位置，從而易于研究離子源的空間位置參數(shù)與信號強度的關(guān)系，達到對離子源的空間位置參數(shù)進行優(yōu)化的目的。實驗使用氨基酸標準溶液等對該調(diào)節(jié)裝置進行測試表征，并與實驗室普通的EESI源做比較實驗，以適于商業(yè)推廣。

圖1 EESI技術(shù)的原理示意圖[6]Fig.1 Schematic diagram of EESI technique[6]

1 EESI源調(diào)節(jié)裝置

為了精確調(diào)節(jié)EESI源的空間位置參數(shù)，本工作研制了一種雙通道左右對稱式的調(diào)節(jié)裝置，主要包括四軸調(diào)節(jié)系統(tǒng)、接口系統(tǒng)、EESI源3個組成部分，其三維模型圖示于圖2a。四軸調(diào)節(jié)系統(tǒng)左右各一個，可分別用于調(diào)節(jié)電噴霧通道與樣品通道的空間位置，從而精確定量調(diào)節(jié)離子源的空間位置參數(shù)，以保證實驗整體的穩(wěn)定性和可重現(xiàn)性。這種條件可滿足對不同樣品的分析，拓寬了實驗方法的通用性，能夠確保不同實驗人員按相同實驗條件進行操作可獲得一致的實驗結(jié)果，降低了操作的隨意性，適用于不同層次的操作者。接口系統(tǒng)的主要功能是將2個四軸調(diào)節(jié)系統(tǒng)耦合在質(zhì)譜儀上，本工作通過逆向工程方法研制了適合LTQ的接口，該接口稍加改動后也可以耦合在其他類型的質(zhì)譜儀上。該EESI源的電噴霧通道和樣品通道在結(jié)構(gòu)上是一樣的，可實現(xiàn)互換，因而具有高通用性和低成本的特點。該調(diào)節(jié)裝置整體上呈左右對稱式布置，位于質(zhì)譜儀進樣口的前下方，實驗時視野開闊，便于觀察與控制實驗過程。

1.1 四軸調(diào)節(jié)系統(tǒng)

四軸調(diào)節(jié)系統(tǒng)由X、Y、Z三個方向的位移調(diào)節(jié)機構(gòu)和B方向上的角度調(diào)節(jié)機構(gòu)串聯(lián)而成，將其耦合在LTQ質(zhì)譜儀上的實物圖示于圖2b。其中，X、Z方向上的位移調(diào)節(jié)機構(gòu)以不銹鋼為主體材料，交叉滾柱導(dǎo)軌支撐，微分頭手動驅(qū)動，彈簧復(fù)位，側(cè)面設(shè)有鎖緊螺釘，線性直線度小于5 μm，線性靈敏度為1 μm，可用于精確調(diào)節(jié)離子源的位置；B軸方向上的角度調(diào)節(jié)機構(gòu)以鋁合金為主體材料，直接粗調(diào)范圍為0～360°，微分頭手動驅(qū)動精調(diào)范圍為±10°、最小刻度2.5°、角度最小讀數(shù)5′，可用于精確調(diào)節(jié)離子源的角度；Y方向上的位移調(diào)節(jié)機構(gòu)與X、Z方向上的機構(gòu)基本一致，微分頭分辨率10 μm，微調(diào)精度5 μm，可用于精確調(diào)節(jié)離子源的高度，提高電噴霧液滴與樣品液滴間的碰撞概率，以獲得較好的分析靈敏度。

注：1. 四軸調(diào)節(jié)系統(tǒng)；2. LTQ接口；3. 電噴霧萃取電離源；4. LTQ進樣口；5. 高壓接口圖2 EESI源調(diào)節(jié)裝置的三維模型圖(a)及其耦合在LTQ質(zhì)譜儀上的實物圖(b)Fig.2 3D model of adjustable device for EESI source (a) and picture of the device coupled to LTQ MS (b)

1.2 電噴霧萃取電離源

注：1. 基體；2. 毛細管鎖緊頭；3. 鎖緊螺頭；4. 毛細管；5. 導(dǎo)氣管；6. 導(dǎo)氣管鎖緊頭圖3 電噴霧(樣品)通道三維外觀圖(a)及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖(b)Fig.3 3D assembly model of electrospray(or sample) channel(a) and its internal structure(b)

電噴霧萃取電離源由電噴霧通道和樣品通道組成，其結(jié)構(gòu)示于圖3。電噴霧通道由基體、毛細管鎖緊頭、鎖緊螺頭(2個)、毛細管、導(dǎo)氣管、導(dǎo)氣管鎖緊頭組成。其中，基體內(nèi)部設(shè)有一沿軸線貫穿中心的通孔，通孔下端部直徑Ф 0.25 mm，中間穿過外徑Ф 0.18 mm的石英毛細管，石英毛細管另一端依次從毛細管鎖緊頭、鎖緊螺頭中間穿過。當(dāng)擰緊鎖緊螺頭時，毛細管鎖緊頭在其作用下向下壓緊基體中心通孔的上端部錐面，這樣就鎖緊并密封了石英毛細管。同時，在基體內(nèi)部與前述貫穿基體中心的通孔傾斜一定角度的方向上，設(shè)置有一斜側(cè)位通孔，該側(cè)位通孔與前述貫穿中心的通孔上端部結(jié)構(gòu)是類似的，導(dǎo)氣管穿過導(dǎo)氣管鎖緊頭、鎖緊螺頭后，穿入其中。當(dāng)擰緊鎖緊螺頭時，導(dǎo)氣管鎖緊頭在鎖緊螺頭的作用下向下壓緊側(cè)位通孔的錐面，這樣就鎖緊并密封了導(dǎo)氣管，高電壓則直接加在溶劑上。樣品通道與電噴霧通道在結(jié)構(gòu)上一樣，區(qū)別在于樣品通道中溶液不加高電壓。因此，兩者具有互換通用性，可簡化裝置結(jié)構(gòu)，降低生產(chǎn)成本。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

LTQ-XL離子阱質(zhì)譜儀(含Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))：美國Thermo Scientific公司產(chǎn)品；普通EESI源：實驗室自制；可調(diào)節(jié)EESI源：本工作研制。

甲醇(色譜純)：美國Tedia公司產(chǎn)品；脯氨酸、纈氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺等氨基酸標準(均為分析純)：上海藍季科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；氯霉素、利血平(優(yōu)級純)：上海晶純生化科技股份有限公司產(chǎn)品；氯化1-己基-3甲基咪唑(分析純)：上海成捷化學(xué)有限公司產(chǎn)品；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)：實驗室自制。

肺癌血液樣品：由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供，已確認患者同意，并簽署了知情同意書。

2.2 實驗條件

萃取劑為甲醇，流速5 mL/min；樣品溶液濃度分別為5～500 μg/L脯氨酸、5～500 μg/L纈氨酸、0.1～500 μg/L組氨酸、0.1～200 μg/L氯霉素、0.05～1 μg/L氯化1-己基-3甲基咪唑、100～700 μg/L利血平；脯氨酸、纈氨酸、組氨酸、氯霉素、氯化1-己基-3甲基咪唑的樣品溶液流速均為5 mL/min，利血平、肺癌患者血液流速為4 mL/min；霧化氣壓力為1 MPa(氮氣鋼瓶表頭壓力，氣體導(dǎo)管為0.16 cm)；萃取劑的電離電壓，氯霉素樣品時為-3 kV(負離子模式)，其他樣品時均為+4 kV(正離子模式)；離子傳輸管的溫度，利血平實驗時為180 ℃，脯氨酸、纈氨酸、組氨酸、氯霉素、氯化1-己基-3甲基咪唑5種樣品實驗時均為150 ℃，用肺癌患者血液實驗時為200 ℃；掃描范圍為各種氨基酸m/z50～200，氯霉素m/z50～500，氯化1-己基-3甲基咪唑m/z50～200，利血平m/z50～800。其他條件由LTQ-XL離子阱質(zhì)譜儀自動優(yōu)化參數(shù)得到。

3 結(jié)果與討論

3.1 六種化合物的測試表征

可調(diào)節(jié)EESI離子源在原有實驗普通離子源的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了離子源各項參數(shù)的精密調(diào)節(jié)，提高了離子源的調(diào)節(jié)準確度和使用穩(wěn)定性。為了驗證可調(diào)節(jié)EESI離子源的這些特征，本實驗使用脯氨酸、纈氨酸、組氨酸、氯霉素、氯化1-己基-3甲基咪唑和利血平的標準品溶液，通過串聯(lián)質(zhì)譜方法對該離子源進行表征。結(jié)果表明，6種化合物的RSD在3.0%～8.2%之間，線性關(guān)系良好，詳細分析數(shù)據(jù)列于表1。

3.2 普通EESI源與可調(diào)節(jié)EESI源的對比實驗

為驗證可調(diào)節(jié)EESI離子源的性能，本實驗選取脯氨酸作為實驗對象，在相同儀器條件和實驗條件下，對普通EESI離子源和可調(diào)節(jié)EESI離子源進行對比實驗，結(jié)果列于表2?？烧{(diào)節(jié)EESI離子源的脯氨酸檢出限為0.075 μg/L，遠小于自制的普通EESI離子源的脯氨酸檢出限0.5 μg/L，且可調(diào)節(jié)EESI離子源的線性略優(yōu)于普通EESI離子源。

表1 六種化合物定量分析數(shù)據(jù)對比

表2 實驗室普通EESI源與可調(diào)節(jié)EESI源對比實驗數(shù)據(jù)

3.3 對血液中的10種氨基酸進行連續(xù)監(jiān)測

為驗證可調(diào)節(jié)EESI離子源在實際樣品測試中的可靠性和長期工作的穩(wěn)定性，為該離子源的商品化提供數(shù)據(jù)支持，本實驗以肺癌患者血樣為實驗樣品，使用可調(diào)節(jié)EESI離子源，通過串聯(lián)質(zhì)譜對樣品中的纈氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、組氨酸、賴氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和谷氨酰胺等10種氨基酸進行連續(xù)5日的檢測，以驗證可調(diào)節(jié)EESI離子源在實際樣品檢測中的穩(wěn)定性和可靠性。各樣品的平均RSD均小于10%，說明該離子源5日內(nèi)的工作穩(wěn)定性相對較好，結(jié)果示于圖4。

圖4 連續(xù)5日檢測同一肺癌患者血液樣本中10種氨基酸信號的變化結(jié)果Fig.4 The curves reflect the repeatability of EESI-MS for measuring trace levels of amino acid in blood sample from lung cancer patients

實驗表明，可調(diào)節(jié)EESI離子源具有樣品信號強度較好、檢出限較低、工作穩(wěn)定等特點。該裝置可為EESI離子源的應(yīng)用推廣和商業(yè)化提供條件。

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Development of Adjustable Device for Extractive Electrospray Ionization with Improved Performance

DONG Xiao-feng, LIU Lin, WANG Jiang, XU Ning, GU Hai-wei,ZHOU Shu-min, CHEN Huan-wen

(JiangxiKeyLaboratoryforMassSpectrometryandInstrumentation,EastChinaInstituteofTechnology,Nanchang330013,China)

Extractive electrospray ionization(EESI) mass spectrometry(MS) has been increasingly used for real time trace analysis of various samples with complex matrices. EESI is easy to be implemented in all types of commercially available MS instruments. However, self-assembled simple EESI source is short of long-term stability. An adjustable device specially developed for EESI source was presented in this work. With parameters of ion source spatial location and MS instrument optimized, the detection limit of EESI using the adjustable device to test proline is reduced from 0.5 μg/L to 0.075 μg/L. The representative amino acids, valine, phenylalanine, proline, histidine, lysine, asparagine, aspartic acid, threonine, tyrosine and glutamine in blood samples obtained from patients with lung cancer have been tested continuously for 5 days and the average RSD for each sample is less than 10%. The experimental results show that the newly developed EESI source has been improved, particularly on the aspects such as stability, precision and sensitivity.

extractive electrospray ionization(EESI); adjustable device; characterization; long-term stability

2014-02-15；

2014-03-16

國家重大儀器專項(2011YQ170067)；江西省科技計劃項目(2010EHA01000)；江西省科技計劃人才項目(2010DD01300)資助

董曉峰(1981～)，男，河南鹿邑人，講師，從事質(zhì)譜儀器研發(fā)。E-mail: dongxiaofeng2013@163.com

陳煥文(1973～)，男，江西興國人，教授，從事質(zhì)譜分析研究。E-mail:chw8868@gmail.com

O 657.63

A

1004-2997(2014)03-0226-06

10.7538/zpxb.2014.35.03.0226