張 鋒，孫 鑫，李 舒，王坤坤，姜海宇，劉露陽，吳長君，汪 勇

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150001；3.意大利百勝公司，哈爾濱 150001)

研究報告

兔股動脈狹窄的超聲與病理對照研究

張 鋒1，孫 鑫2，李 舒1，王坤坤1，姜海宇1，劉露陽1，吳長君1，汪 勇3

(1. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院超聲科，哈爾濱 150001；2. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，哈爾濱 150001；3.意大利百勝公司，哈爾濱 150001)

目的 探討高頻超聲在兔股動脈狹窄的應(yīng)用價值。方法 24只新西蘭兔隨機(jī)分為三組，每組8只，制備兔股動脈硬化模型：股動脈球囊損傷后分別高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周，取耳緣靜脈血檢測膽固醇水平的變化，采用18 MHz超高頻超聲探頭觀察股動脈的狹窄情況，測量造模處直徑狹窄率、收縮期峰值血流速度(PSV)，病理檢測動脈管腔的面積狹窄率。結(jié)果 (1)隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長，血中膽固醇水平遞增，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。(2)與造模前(0周)相比較，高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周時股動脈造模處出現(xiàn)不同程度的狹窄，狹窄程度隨時間延長逐漸增加，組間兩兩比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；狹窄處收縮期血流峰值流速隨著狹窄程度的增加而加快，組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。(3)隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長，病理組織的面積狹窄率增加，組間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論 (1)高脂喂養(yǎng)加球囊損傷能造成不同程度的兔股動脈狹窄；(2)超高頻超聲能夠清晰地顯示不同程度的兔股動脈狹窄，可用于動物外周血管疾病模型的檢測。

超高頻超聲；直徑狹窄率，收縮期峰值流速(PSV)；動脈狹窄，面積狹窄率；兔

冠心病、糖尿病是常見病、多發(fā)病，在我國發(fā)病率逐年上升，并且常累及動脈系統(tǒng)，引起外周血管疾病，隨著病變的進(jìn)展，病人出現(xiàn)間歇性跛行、靜息痛等癥狀。下肢血管病變是糖尿病病人致死致殘的主要原因，據(jù)統(tǒng)計，糖尿病患者的下肢截肢率是非糖尿病患者的15倍，50%的截肢患者在四年內(nèi)進(jìn)行對側(cè)截肢。因此，早期發(fā)現(xiàn)、診斷病變，阻止病情進(jìn)一步發(fā)展，將有助于疾病的預(yù)后。為了達(dá)到這一目的，很多學(xué)者已經(jīng)利用動物模型在動脈硬化的形成機(jī)制方面做了大量的研究，但目前的文獻(xiàn)顯示動脈硬化動物模型的檢測手段大部分仍然僅局限于組織的病理學(xué)診斷，這一現(xiàn)狀一定程度上限制了科學(xué)研究在動物實驗中的進(jìn)展。本研究擬采用18 MHz超高頻超聲探頭評估兔股動脈的狹窄，探討超高頻超聲在實驗動物外周血管疾病中的應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇24只雄性新西蘭兔，體質(zhì)量(2.5～3.0)kg，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心提供(實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(黑)2013-001，實驗動物使用合格證號SYXK(黑)2013-002)。

1.2 動物分組及模型的制備

24只實驗兔隨機(jī)分為三組，每組8只，均進(jìn)行雙側(cè)股動脈球囊損傷。使用戊巴比妥鈉(30 mg/mL)耳緣靜脈注射麻醉，劑量為30 mg/kg，麻醉后將動物固定于兔臺上。電推去術(shù)區(qū)毛發(fā)，手觸及股動脈搏動后，局部消毒、開皮、分離股動脈，找到股動脈主干和其分叉腘動脈及隱動脈，耳緣靜脈注入肝素，動脈夾夾閉股動脈近心端，手術(shù)縫線結(jié)扎腘動脈遠(yuǎn)心端，眼科剪剪開腘動脈近心端(距離股動脈分叉點2 cm)，插入球囊(2.0 × 15) mm距離股動脈分叉約1.5 cm處，6～8 atm打入球囊中，來回拉動球囊三次損傷動脈內(nèi)膜，撤去球囊壓力，拔出球囊，結(jié)扎腘動脈近心端，逐層縫合肌肉及皮膚。術(shù)后肌注青霉素5 d(40萬單位/d)，三組實驗動物術(shù)后分別高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周。高脂飼料成分為：1.5%膽固醇，10%豬油，7.5%蛋黃粉。

1.3 實驗儀器及試劑

Mylab90彩色多普勒超聲診斷儀(百勝公司)，LA435線陣探頭，探頭中心頻率18 MHz(百勝公司)，光學(xué)顯微鏡(Nikon 公司)，切片機(jī)(德國徠卡公司)，戊巴比妥鈉(Sigma 公司)，多聚甲醛( Sigma公司)，肝素鈉(天津藥業(yè)焦作有限公司)，青霉素(山西振東泰盛制藥有限公司)，HE染色液(湖北泰康醫(yī)療設(shè)備有限公司)。

1.4 超聲掃查內(nèi)容

分別于造模前(即0周)、4周、8周、12周進(jìn)行超聲檢查，掃查深度及增益條件均保持一致。觀察雙側(cè)股動脈長軸方向距離股動脈分叉前1.5 cm處有無斑塊形成，及管腔狹窄處的直徑狹窄率(D%)，彩色多普勒超聲觀察動脈管腔內(nèi)的血流充盈情況，測定狹窄處的收縮期峰值血流速度(PSV)。

1.5 血膽固醇水平的測定

分別檢測0周、4周、8周、12周靜脈血中總膽固醇的水平。

1.6 病理檢測

三組實驗動物于4周、8周、12周行病理取材，取材部位為股動脈分叉前(1～2)cm，4% 甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片和HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察動脈管腔的組織形態(tài)學(xué)特點，并測量動脈管腔的面積狹窄率。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組兔血中膽固醇水平結(jié)果分析

4周、8周、12周兔血膽固醇水平別為(535.98±136.36)mg/dL、(1144.32±156.01)mg/dL、(1943.46±182.27)mg/dL，與0周的(63.61±34.08)mg/dL比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；三組之間血中總膽固醇水平兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖1)，即隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長，血中膽固醇水平遞增。

圖1 各組間血膽固醇水平比較(*** P<0.001)Fig.1 Comparison of blood cholesterol levels at different time points

2.2 超聲檢查結(jié)果分析

A：0周、4周、8周、12周時動脈管腔的血流充盈情況； B：0周、4周、8周、12周時動脈管腔狹窄處收縮期峰值 流速(PSV)；C：4周、8周、12周時動脈管腔的直徑 狹窄率(#無統(tǒng)計學(xué)意義、** P<0.01，***P<0.001)圖2 各時間點動脈管腔的直徑狹窄率 及收縮期峰值血流速度 A：Blood filling condition at the time of 0 w, 4 w, 8 w and 12 w. B：The peak systolic velocity (PSV) at the stenosis site of the artery lumen at 0 w, 4 w, 8 w and 12 w.C：The diameter stenosis rate of arterial lumen at 4 w, 8 w, and 12 w.Fig.2 The diameter stenosis rate and peak systolic velocity at different time points

與0周時相比較，4周、8周、12周時股動脈造模處出現(xiàn)不同程度的狹窄，超聲直徑狹窄率分別為(42.25±8.50)%、(59.37±4.53)%、(77.37±5.70)%，8周與4周相比、12周與8周相比均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，隨著時間的延長，動脈狹窄程度逐漸增加；狹窄處收縮期血流峰值流速分別為(25.1±4.86)cm/s，(34.68±6.18)cm/s，(45.98±6.47)cm/s，8周與4周、12周與8周組間比較具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，4周與0周時相比，血流速度呈上升趨勢，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。2.3 病理組織學(xué)面積狹窄率及組間比較

球囊損傷加高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周后，造模處的動脈管腔內(nèi)均出現(xiàn)狹窄，病理組織學(xué)的面積狹窄率分別為(50.78±7.28)%、(67.77±6.81)%、(83.20±7.95)%，8周與4周、12周與8周之間比較均具有統(tǒng)計學(xué)差異(P分別小于0.001、0.01)，隨著時間的延長，動脈管腔橫斷面的殘余面積逐漸減少。(圖3)

注：A：0周、4周、8周、12周時的動脈管腔狹窄情況； B： 4周、8周、12周時組織面積狹窄率組間比較；圖3 動脈管腔組織學(xué)的面積狹窄率 A：The artery lumen stenosis at 0 w, 4 w, 8 w and 12 w. B：Comparison of tissue areal stenosis at 4 w, 8 w and 12 w.Fig.3 Histological areal stenosis of the arterial lumen

2.4 病理與超聲結(jié)果對照分析

球囊損傷加高脂喂養(yǎng)4周、8周、12周的超聲直徑狹窄率與病理組織的面積狹窄率相關(guān)性分析結(jié)果表明， R2=0.60，P<0.001，二者呈線性正相關(guān)(圖4)。

圖4 組織面積狹窄率與超聲直徑狹窄率相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis of the tissue area stenosis rate and ultrasonic diameter stenosis rate

3 討論

外周血管疾病是指冠狀動脈以外的動脈狹窄或閉塞性病變，主要在心血管疾病、糖尿病的人群中發(fā)病率比較高，以動脈粥樣硬化性外周動脈疾病和糖尿病足為主要表現(xiàn)。此類患者發(fā)病早期可以無明顯臨床癥狀，隨著病程的進(jìn)展，病情逐漸加重，極大地降低了患者的生活質(zhì)量，增加了致殘率和致死率，給社會和家庭都帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，同時，外周血管疾病是全身系統(tǒng)性疾病，經(jīng)常與其他血管病變?nèi)珙i動脈粥樣硬化同時存在，而后者則是腦缺血疾病危險增高的標(biāo)志，對腦梗死有一定的預(yù)測價值[1，2]。研究表明，股動脈的硬化比頸動脈硬化發(fā)生的更早[3]，Lekakis等[4]研究發(fā)現(xiàn)股總動脈內(nèi)中膜厚度是冠狀動脈疾病的獨立預(yù)測因子，且與冠狀動脈硬化呈正相關(guān)。因此，建立可靠的動物模型并選擇實時、有效、可重復(fù)性好的檢測手段，對于研究外周血管疾病很有科研價值。

球囊損傷加高脂喂養(yǎng)是目前動物模型中最常用的一種動脈硬化造模方法[5-8]，本研究采用此方法成功構(gòu)建了兔雙側(cè)股動脈狹窄的模型，與文獻(xiàn)報道相符[9-10]。本實驗結(jié)果顯示，在球囊損傷加高脂喂養(yǎng)后4周末即出現(xiàn)了血膽固醇水平升高，病理組織學(xué)顯示動脈管腔呈50%左右的狹窄;8周末、12周末血中膽固醇水平進(jìn)一步顯著升高，病理組織學(xué)的管腔狹窄率分別達(dá)到了60%、75%，這與文獻(xiàn)中所報道的8周出現(xiàn)典型的動脈硬化的結(jié)果相一致[10]。

現(xiàn)有的研究結(jié)果顯示，動脈硬化動物模型的檢測手段大部分局限于血中脂類成分的檢測及病理組織學(xué)的診斷[5]，僅有少數(shù)文獻(xiàn)顯示超聲技術(shù)用于動脈硬化模型檢測動物脂肪肝水平及頸動脈脈內(nèi)-中膜厚度的變化[11-14]。目前，高頻超聲技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于淺表器官疾病的診斷，包括頸動脈疾病、皮下軟組織、乳腺、甲狀腺等方面；高頻超聲被認(rèn)為是一種無創(chuàng)的、可靠的評價人頸動脈內(nèi)中膜厚度的手段，與MRA、動脈造影相比，更經(jīng)濟(jì)、重復(fù)性更好。以往的研究表明[15-19]，5-12 MHz高頻超聲探頭在診斷正常臂部尺神經(jīng)及正中神經(jīng)病變、外周血管疾病、小兒腹部疾病及腮腺腫瘤方面有肯定的診斷價值；20 MHz超高頻超聲在診斷乳腺病變、陰莖硬結(jié)、眼、甲狀腺等淺表器官病變的診斷已取得顯著效果[20-23]。 Latham等[23]人使用50 MHz的超高頻微型超聲探頭檢測術(shù)中尺、橈動脈穿刺置管過程，取得滿意的檢測圖像，尤其是在6歲以下兒童的術(shù)中麻醉中具有明確的引導(dǎo)作用。人和動物股動脈位置均比較表淺，本研究采用18 MHz超高頻超聲探頭觀察實驗兔股動脈狹窄的情況，結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)4周以后，超聲可以探測到動脈管腔出現(xiàn)了大于40%的狹窄，高脂喂養(yǎng)8周后動脈管腔的超聲直徑狹窄率在50%以上，與病理組織學(xué)的面積狹窄率保持一致，二者呈高度正相關(guān)(R2=0.60)。在本實驗中8周和12周組分別有1只、3只兔股動脈出現(xiàn)完全堵塞，動脈管腔內(nèi)充滿低回聲，未探及血流信號；隨著狹窄程度的增加，4周管腔內(nèi)狹窄處的血流速度呈現(xiàn)上升的趨勢，但與造模前相比并無統(tǒng)計學(xué)意義，8周、12周狹窄處的收縮期峰值流速明顯加快，血流頻譜舒張期反向波，失去動脈血流的三相波特點，呈典型的動脈狹窄性改變。

綜上所述，球囊損傷聯(lián)合高脂喂養(yǎng)可以造成不同程度的兔股動脈狹窄，且隨著喂養(yǎng)時間的延長，動脈的狹窄程度增加；18 MHz超高頻超聲探頭的應(yīng)用可以清晰顯示兔股動脈的管壁結(jié)構(gòu)、管腔內(nèi)狹窄及血流充盈的情況，對顯示動物模型中外周動脈狹窄具有靈活、直觀、無創(chuàng)、可重復(fù)性好等優(yōu)點，能夠為動物實驗尤其是取血受限的小型動物研究的順利進(jìn)行提供便利的條件。

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Comparative study of ultrasonography and pathology in rabbit models of femoral artery stenosis

ZHANG Feng1, SUN Xin2, LI Shu1, WANG Kun-kun1, JIANG Hai-yu1, LIU Lu-yang1, WU Chang-jun1, WANG Yong3

(1. The First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Department of Ultrasound, Harbin 150001;2. Department of Cardiology, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Haerbin 150001, China;3. Italy yum, Haerbin 150001)

Objective To explore the application value of ultra-high frequency ultrasound in detection of femoral artery stenosis in rabbits. Methods Twenty-four healthy male New Zealand white rabbits (body weight 2.5-3.0 kg) were randomly divided into three groups, 8 rabbits in each group. Preparation of femoral atherosclerosis model: the rabbits were fed with high fat diet for 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks after femoral artery balloon injury, respectively. The changes of cholesterol level were observed. We used ultra-high frequency ultrasonic probe to observe the femoral artery, to assess the diameter stenosis rate and peak systolic velocity (SPV) at the symptomatic side, and the histological areal stenosis was evaluated. Results 1. The blood cholesterol levels were increased after fed high cholesterol diet, with a significant difference among the groups (P<0.001); 2. There was a stenosis to a different degree in the modeling artery after fed high cholesterol diet for 4 wks, 8 wks, and 12 wks, and the stenosis degree was increased gradually. At 12 w, the degree of stenosis was higher than that at 4 w and 8 w, respectively, showing statistical significance (P<0.001). At the symptomatic side, the peak systolic flow velocity was increased, and it was higher at 12 w than that at 4w and 8 w, respectively. 3. With the extension of time, the arterial stenosis rate was increased along with the time course (P<0.05). Conclusions 1. High fat diet combined with balloon injury can cause varying degrees of rabbit femoral artery stenosis; 2. Ultrahigh frequency ultrasound can clearly show different degrees of rabbit femoral artery stenosis, and can be used for detecting the lesions in animal models of peripheral vascular diseases.

Ultra-high frequency ultrasound; Diameter stenosis rate; Peak systolic low velocity (PSV); Atherosclerosis; Area stenosis rate; Rabbit

張鋒(1982-)，女，博士研究生，E-mail： doctor_zf@163.com。

吳長君(1964-)，女，博士，教授，從事超聲診斷學(xué)研究，E-mail： bccjw@sohu.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0019-05

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.005

2014-06-20