蘇靜芬，張 晨，李雨函，劉先菊，佟 巍，向志光，石 亮，石桂英，劉云波

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 100871)

研究報(bào)告

恒河猴p53基因沉默靶點(diǎn)在細(xì)胞水平的驗(yàn)證

蘇靜芬1，張 晨2，李雨函1，劉先菊1，佟 巍1，向志光1，石 亮1，石桂英1，劉云波1

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021；2.北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 100871)

目的 為建立恒河猴p53基因沉默模型，首先在細(xì)胞水平篩選和測(cè)定恒河猴p53基因有效沉默靶點(diǎn)。方法 測(cè)定非洲綠猴腎來源成纖維細(xì)胞COS-7中p53基因的表達(dá)水平；對(duì)恒河猴p53 基因做生物信息學(xué)分析，優(yōu)選靶序列設(shè)計(jì)shRNA，克隆入慢病毒載體FUGW-TDT，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，以real-time PCR檢測(cè)p53 mRNA抑制水平，以 Western blot 檢測(cè) p53蛋白水平表達(dá)變化。結(jié)果 在COS-7細(xì)胞檢測(cè)到p53基因的表達(dá)；生物信息學(xué)篩選到3個(gè)靶片段，分別位于p53 mRNA的238～258 bp,681～701 bp,169～189bp，均在開放閱讀框內(nèi)； p53三個(gè)靶位點(diǎn)的沉默效率在mRNA水平分別為(87.17±4.03)%，(72.62±4.11)%，(76.22±0.98)%；在蛋白水平的沉默效率分別為(84.44±2.18)%，(71.04±1.18)%，(74.17±0.95)%。結(jié)論 在細(xì)胞水平篩選得到3個(gè)有效的p53基因沉默靶點(diǎn)，可用于后續(xù)的恒河猴基因沉默研究。

基因沉默；p53 基因；恒河猴

嚙齒類動(dòng)物與人類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，物種間的種屬差異使得嚙齒類動(dòng)物的腫瘤模型在應(yīng)用中受到諸多因素的限制[1]。恒河猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在親緣關(guān)系上和人最接近，因此建立腫瘤的非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型對(duì)于相關(guān)疾病的研究具有重要的意義。

恒河猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物存在一定的自發(fā)腫瘤，以消化系統(tǒng)腫瘤為多[2]，但腫瘤發(fā)生率，尤其是肌肉骨骼和呼吸系統(tǒng)腫瘤發(fā)生率較低[3]，因此較難使用恒河猴的自發(fā)腫瘤來建立動(dòng)物腫瘤模型。隨著轉(zhuǎn)基因等技術(shù)在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的操作成功[4]，通過基因修飾來改變恒河猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腫瘤易感性，從而最終建立有效的腫瘤動(dòng)物模型已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。

p53基因是十分重要的抑癌基因，p53基因缺失或基因突變?cè)谀[瘤的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。在原發(fā)性腫瘤中p53突變發(fā)生率近50%[5]。在恒河猴等非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物抑制p53基因的表達(dá)水平有可能提高其腫瘤發(fā)生率，從而建立可用的腫瘤模型?；赗NA干擾技術(shù)的日臻成熟，而p53異常與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，為建立恒河猴p53基因沉默模型，本文將首先在細(xì)胞水平篩選和測(cè)定恒河猴p53基因有效沉默靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

COS-7細(xì)胞來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)研究所細(xì)胞中心，Vero, Vero-E6細(xì)胞來自ATCC細(xì)胞庫。細(xì)胞所用培養(yǎng)液為DMEM(Hyclone),含10%胎牛血清(Gibco)。在含5%CO2的37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1 .2 p53-RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建

慢病毒載體FUGW-TDT含有ubiquitin promoter(Ubi promoter)調(diào)控的紅色熒光蛋白tandem dimer Tomato(tdt)報(bào)告基因，與U6啟動(dòng)子調(diào)控的RNA干擾片段共表達(dá)。

根據(jù)恒河猴p53基因的序列，依照shRNA的設(shè)計(jì)原則和Life Technology在線設(shè)計(jì)工具，選擇了3個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了shRNA序列。將目的片段連至經(jīng)Xho I和Xba I雙酶切后的線性化慢病毒載體FUGW-TDT中，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(全式金公司)，挑單菌落培養(yǎng)后進(jìn)行菌液鑒定及測(cè)序(菌液PCR及測(cè)序引物均為F:5’-AGGAAGATGGCT GTGAGG-3’;R:5’-GCCTTGTATCGTATAAGC-3’)，挑取陽性克隆菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提并且命名為FUGW-TDT-shP53,本實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照為不含shRNA 的FUGW-TDT空質(zhì)粒。

1.3 慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞

第1天在六孔板中按(6～8)×105細(xì)胞/孔接種細(xì)胞，第2天細(xì)胞密度達(dá)60%～80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。本實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)染試劑為polyethylenimine(Polysciences)，簡(jiǎn)稱PEI。按質(zhì)粒：PEI=1:3的比例配制轉(zhuǎn)染混合物，震蕩混勻靜置30 min后滴入六孔板中，避免震蕩。每個(gè)質(zhì)粒做3個(gè)復(fù)孔。48 h后觀察熒光并進(jìn)行流式分選。

1.4 用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分選紅色熒光細(xì)胞

收取轉(zhuǎn)染48 h后細(xì)胞，PBS洗3遍，離心去除上清液，用200 μL PBS 重懸，用200目尼龍膜過濾后，上機(jī)(BD,Aria I)分選。

1.5 普通PCR和SYBR-Green法實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照Invitrogen Trizol Reagent說明書抽提細(xì)胞總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)按照試劑盒說明書操作。p53基因所用引物為F:5’- CCCTTCCCAGA AAACCTACC-3’, R:5’-CTCCGTCATGTGCTGTGAC T-3’ 預(yù)計(jì)擴(kuò)增出223 bp左右的目的片段。內(nèi)參GAPDH的引物選自文獻(xiàn)[6]，F(xiàn):5’-ACATCATCCCT GCCTCTACTGG-3’，R:5’-AGTGGGTGTCGCTTTGA AGTC-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增出261bp左右的目的片段。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.6 Western Blot

將細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉，用 PBS洗細(xì)胞2 次，然后棄掉，加入蛋白裂解液，吹打均勻后吸入1.5 mL EP管，離心棄沉淀，測(cè)定濃度。總蛋白上樣量為20 μg。取適量上清液與sample buffer 混合。沸水煮變性后離心。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜加一抗(mouse anti-monkey p53, Santa Cruz)，二抗，然后X-膠片曝光，暗室顯影。最后用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度掃描分析。

表1 恒河猴p53基因沉默靶點(diǎn)Tab.1 The gene silence sites of rhesus monkey p53

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Student’st檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)分析

根據(jù)恒河猴p53基因序列，依照shRNA的設(shè)計(jì)原則和Life Technology 網(wǎng)站(http://rnaidesigner.lifetechnologies.com/rnaiexpress/setOption.do?design Option=shrna&pid=261946071111563135)選擇了3個(gè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了shRNA序列，具體序列和在恒河猴p53 mRNA中的位置見表1。3個(gè)靶點(diǎn)均與非洲綠猴p53基因100%同源。

2.2 p53-RNA干擾慢病毒載體構(gòu)建

首先將針對(duì)靶位點(diǎn)的21 nt寡核苷酸的以正反向組合，中間添加loop環(huán)結(jié)構(gòu)(序列為CTCAAGAGA)，使寡核苷酸可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。另添加轉(zhuǎn)錄終止子TTTTTT。并且在正義鏈模板的5’端添加XhoI酶切位點(diǎn)，在反義鏈模板的5’端添加XbaI酶切位點(diǎn)。由此合成靶序列的oligoDNA(圖1A)。之后將oligoDNA連接在U6啟動(dòng)子的下游，成功構(gòu)建FUGW-TDT-p53shRNA載體(圖1B)。

注:A: 針對(duì)恒河猴p53的特異的shRNA-1的 雙鏈寡核苷酸DNA序列的正義鏈； B：FUGW-TDT-shp53慢病毒載體圖1 結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 The frame of FUGW-TDT-shp53

2.3 p53 細(xì)胞豐度檢測(cè)

我們選取了COS-7、Vero、Vero-E6三種細(xì)胞檢測(cè)p53豐度，提取RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,普通PCR后電泳(圖2)。結(jié)果顯示三種細(xì)胞p53的豐度均較高，我們選取COS-7用于基因抑制效率檢測(cè)。

注：圖示為p53在COS-7，Vero, Vero-E6 三種細(xì)胞的豐度。H2O為陰性對(duì)照。圖2 p53 細(xì)胞豐度檢測(cè)Note. There is the abundance of three types of cells: COS-7，Vero, and Vero-E6 cells. H2O is the negative control.Fig.2 Detection of the p53 abundance

2.4 p53 mRNA 水平沉默效率檢測(cè)

為了確定3個(gè)shRNA質(zhì)粒的沉默效率，在轉(zhuǎn)染48 h之后，trizol法分別抽提RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行real-time PCR，按2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。如圖3所示，與對(duì)照FUGW-TDT相比，3個(gè)shRNA對(duì)應(yīng)的P53 基因mRNA表達(dá)量均明顯降低(P<0.05)。其中FUGW-TDT- shp53-1的沉默效率為(87.17±4.03)%，F(xiàn)UGW-TDT- shp53-2的沉默效率為(72.62±4.11)%，F(xiàn)UGW-TDT- shp53-3的沉默效率為(76.22±0.98)%。三個(gè)靶位點(diǎn)在p53 mRNA 水平的沉默效率均很明顯。

注：1:對(duì)照組FUGW-TDT；2:FUGW-TDT-shp53-1； 3: FUGW-TDT-shp53-2；4: FUGW-TDT- shp53-3； n=3,*代表P<0.05 vs對(duì)照組FUGW-TDT圖3 SYBR-Green法Real-time PCR 檢測(cè)p53 基因mRNA的表達(dá)Note.1. Control group FUGW-TDT; 2. FUGW-TDT-shp53-1; 3: FUGW-TDT-shp53-2; 4: FUGW-TDT-shp53-3; n=3,*means P<0.05 vs. control group FUGW-TDT.Fig.3 Detection of p53 mRNA by real-time PCR

注:圖A:Western Blot圖 B:灰度掃描圖像分析結(jié)果圖4 Western Blot檢測(cè)p53 蛋白的表達(dá)1:FUGW-TDT-shp53-1；2: FUGW-TDT-shp53-2； 3: FUGW-TDT-shp53-3；4:FUGW-TDT； n=3,*表示P<0.05 vs. 對(duì)照組FUGW-TDTFig.4 Detection of p53 protein by Western blot

2.5 p53 蛋白水平沉默效率檢測(cè)

Western Blot檢測(cè)p53 基因蛋白的表達(dá),結(jié)果表明轉(zhuǎn)染了p53shRNA的細(xì)胞，蛋白表達(dá)量明顯低于轉(zhuǎn)染了FUGW-TDT的對(duì)照組(圖4 A)。其中FUGW-TDT-shp53-1的沉默效率為(84.44±2.18)%，F(xiàn)UGW-TDT-shp53-2的沉默效率為(71.04±1.18)%，F(xiàn)UGW-TDT-shp53-3的沉默效率為(74.17±0.95)%(圖4 B)。三個(gè)靶位點(diǎn)在p53蛋白水平的沉默效率均很明顯。Western Blot的結(jié)果和real-time PCR保持一致。

3 討論

p53基因是人類研究的最多的抑癌基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，p53+/-,p53-/-高度腫瘤易感, 早期自發(fā)成瘤，而以淋巴瘤和肉瘤占主體。p53mutant /+,p53mutant /-上皮組織來源的瘤比例大幅提高，腫瘤轉(zhuǎn)移率較高[7,8]。但目前還沒有利用p53基因沉默來誘發(fā)腫瘤的報(bào)道，更沒有人在非人靈長(zhǎng)類上利用p53基因沉默來誘發(fā)腫瘤的報(bào)道。為建立恒河猴p53基因沉默誘導(dǎo)的腫瘤模型，首先在細(xì)胞水平篩選和測(cè)定恒河猴p53基因有效沉默靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)利用RNA干擾技術(shù)在COS-7細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了p53基因沉默。通過設(shè)計(jì)針對(duì)非人靈長(zhǎng)類p53基因的干擾序列，構(gòu)建FUGW-TDT-shRNA載體，轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot分析RNA干擾的COS-7細(xì)胞中p53 mRNA水平和蛋白表達(dá)量均比對(duì)照組顯著降低。Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果完全吻合，說明這三個(gè)p53 沉默位點(diǎn)都是有效的，均適合用于后續(xù)的恒河猴胚胎和個(gè)體水平上的實(shí)驗(yàn)?？梢赃M(jìn)行病毒包裝后在恒河猴胚胎和個(gè)體水平繼續(xù)驗(yàn)證，以期建立非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物腫瘤模型。

質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大。原本具有沉默效率的靶點(diǎn)可能因?yàn)檗D(zhuǎn)染效率較低而無法在mRNA和蛋白水平顯示，呈假陰性。為此可采用藥物篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，也可瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后流式分選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)采用了流式細(xì)胞儀分選紅色熒光細(xì)胞，從而使三個(gè)靶位點(diǎn)在mRNA和蛋白水平的沉默效率得以充分顯示。

致謝：感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所的張連峰教授，宋銘晶副教授在實(shí)驗(yàn)思路上的指導(dǎo)，感謝張麗芳老師、?；劾蠋熢趯?shí)驗(yàn)方法上的幫助，感謝同學(xué)馬元武、修晶輝、鮑丹、陳巍、隋小龍、馬婧及北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的同學(xué)汪霞、賈漠野在具體實(shí)驗(yàn)操作或數(shù)據(jù)分析整理上的幫助。

[1] Daniels TR, Martínez-Maza O,Penichet ML.Animal models for IgE-mediated cancer immunotherapy[J].Cancer Immunol Immunother. 2012,61(9):1535-1546.

[2] Beniashvili DS. An overview of the world literature on spontaneous tumors in nonhuman primates [J]. J Med Primatol, 1989,18:423-437.

[3] Cianciolo RE, Butler SD, Eggers JS,et al. Spontaneous neoplasia in the baboon[J]. J Med Primatol.2007,36(2):61-79.

[4] Anthony W,Chan S.Progress and prospects for genetic modification of nonhuman primate models in biomedical research [J].ILAR J, 2013,54(2):211-223.

[5] Soussi T,Béroud C.Assessing TP53 status in human tumours to evaluate clinical outcome [J]．Nat Rev Cancer,2001,l(3):233-240．

[6] Zhou HW, Lou SQ,Zhang K. Recovery of function in osteoarthritic chondrocytes induced by p16INK4a-specificsiRNA in vitro[J]. Rheumatology,2004,43:555-568.

[7] Olive KP,Tuveson DA,Ruhe ZC,Yin B, et al.Mutant p53 gain of function in two mouse models of Li-Fraumeni syndrome[J].Cell,2004,119(6):847-860.

[8] Lang GA,1wakuma T,Suh YA,et al. Gain of function of a p53 hot spot mutation in a mouse model of Li-Fraumeni syndrome[J].Cell,2004, 119(6):861-872.

Rhesus monkey P53 gene silencing at the cellular level

SU Jing-fen1, ZHANG Chen2,LI Yu-han1, LIU Xian-ju1, TONG Wei1, XIANG Zhi-guang1,SHI Liang1,SHI Gui-ying1,LIU Yun-bo1

(1. Institude of Medical Laboratory Animal Science,Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100021, China;2.College of Life Science, Peking University, Beijing 100871)

Objective In order to establish a rhesus monkey model of p53 gene silencing, firstly we screened and determined the effective silencing targets of p53 gene at the cellular level in rhesus monkey.Methods The expression of p53 gene was detected in COS-7 cells (derived from the kidney of the African Green Monkey,Cercopithecusaethiops).Three small hairpin RNA (shRNA) sequences targeting rhesus monkey p53 gene were designed, analysed by bioinformatics, and inserted into lentivirus-based gene silencing constructs FUGW-TDT. The plasmids of p53-RNAi and control vector were transfected into the COS-7 cells, respectively.The suppression of p53 mRNA was detected by real-time PCR, and the changes of p53 protein expression were detected by Western blot assay. Results p53 gene expression was detected in COS-7 cells.Bioinformatics analysis showed that three gene-silencing sequences were screened which lied in the open reading frame (ORF) region and targeted 238-258bp, 681-701bp, 169-189bp of the rhesus monkey p53 mRNA.At 48 hrs after transfection of the three silencing constructs, p53 mRNA was suppressed by(87.17±4.03)%, (72.62±4.11)% and(76.22±0.98)%, and p53 protein was suppressed by (84.44±2.18)%, (71.04±1.18)% and (74.17±0.95)%, respectively. Conclusions We obtained three effective target sequences showing high efficiency in p53silencing, which can be used in further studies on gene silencing in rhesus monkey.

Gene silence; p53 gene; Rhesus monkey

國家科技支撐計(jì)劃(No.2014BAI03B01)。

蘇靜芬(1987- )，女，碩士研究生,研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail: jingfensu@126.com。

劉云波，E-mail: yunboliu@126.com。

R33

A

1671-7856(2014) 08-0007-04

10.3969.j.issn.1671.7856. 2014.008.002

2014-06-20