俞 頔, 崔志松, 沈冰芳, 李馨子, 鄭 立, 孫永革,3*

(1. 浙江大學(xué) 地球科學(xué)系, 浙江 杭州 310027; 2. 國家海洋局 第一海洋研究所 海洋生態(tài)研究中心, 山東 青島266061; 3. 中國科學(xué)院 廣州地球化學(xué)研究所 有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640)

0 引 言

萘與萘系物是一類常見的多環(huán)芳烴(圖1), 因萘環(huán)的疏水性導(dǎo)致其易于被微粒所吸附而廣泛存在于環(huán)境中[1], 其毒性和致癌性已備受關(guān)注[2–3]。萘的烷基取代異構(gòu)體不僅是沉積有機(jī)質(zhì)(包括石油、煤)的主要成分之一, 而且也是石油化工生產(chǎn)和加工過程中的主要產(chǎn)物之一, 如1,6-二甲基萘、1,2,5-三甲基萘、1,2,3,5-四甲基萘、1,2,3,5,6-五甲基萘等[4], 其生物致毒性與其母體分子相當(dāng)或更強(qiáng), 由此引起的污染一旦擴(kuò)散到環(huán)境中, 將對區(qū)域生態(tài)環(huán)境造成巨大威脅[5]。

圖1 萘的分子結(jié)構(gòu)和碳位編號Fig.1 Chemical structure and numbering of the naphthalene carbon skeleton

自然環(huán)境中, 烷基萘類多環(huán)芳烴的降解主要依靠細(xì)菌和真菌的生物作用[6], 因此, 研究烷基萘在表生環(huán)境中的降解過程、效率、影響因素對于污染環(huán)境的生物修復(fù)具有重要指導(dǎo)意義。烷基萘的生物降解研究最早見于石油地球化學(xué)領(lǐng)域。20世紀(jì) 80年代初, Volkman et al.[7]利用色譜質(zhì)譜技術(shù), 研究了生物降解作用對石油中甲基萘和二甲基萘異構(gòu)體分布的影響, 發(fā)現(xiàn)生物降解速率與烷基萘的取代基數(shù)量和位置有關(guān), 取代基數(shù)量越多, 越難被降解; 相對于α位取代萘, β位取代異構(gòu)體更易被降解。Fisher et al.[8]的研究從實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象上概括了烷基萘存在1號和 6號位取代基的異構(gòu)體易遭受生物降解的現(xiàn)象,但未涉及烷基萘生物降解現(xiàn)象控制因素的本質(zhì)。Huang et al.[9]通過一個(gè)自然降解油藏剖面的系統(tǒng)分析, 給出了烷基萘的生物降解順序, 指出烷基化程度越高的異構(gòu)體, 抗生物降解程度越高, 同時(shí)指出,烷基萘生物降解過程不同于熱力學(xué)降解過程, 熱力學(xué)穩(wěn)定的異構(gòu)體更易遭到生物降解。所有這些研究表明, 烷基萘不同異構(gòu)體之間的生物降解存在顯著差異性, 而導(dǎo)致這種差異性的根本原因可能與烷基萘異構(gòu)體分子結(jié)構(gòu)有關(guān), 內(nèi)能低且結(jié)構(gòu)緊密的異構(gòu)體相對容易被生物降解[10]。最近, Ostoji? et al.[11]利用目標(biāo)化合物化學(xué)勢、偶極距、極化率等與生物降解率的關(guān)系, 通過密度泛函理論和極化連續(xù)模型,對三甲基萘各異構(gòu)體的極化率和偶極矩進(jìn)行了計(jì)算,結(jié)果顯示, 三甲基萘各個(gè)異構(gòu)體電離能基本相等,而靜態(tài)偶極極化率平均值從 α,α,α-三甲基萘到 β,β,β-三甲基萘的取代基變化過程中不斷增加, 說明色散力和電感力對三甲基萘異構(gòu)體和細(xì)菌特定酶的活性位點(diǎn)的親和力有影響。據(jù)此, Ostoji? et al.[11]提出可以利用三甲基萘異構(gòu)體極化率對其生物降解率進(jìn)行預(yù)測, 并從理論上給出了表生環(huán)境中烷基萘異構(gòu)體的可能降解順序。

盡管 Ostoji? et al.[11]的預(yù)測結(jié)果與地質(zhì)油藏所觀察到的烷基萘降解過程有較好的相似性, 但與表生好氧環(huán)境相比, 地質(zhì)油藏中石油的降解主要屬于厭氧過程[12], 因此, Ostoji? et al.[11]的推測是否存在于表生環(huán)境仍是一個(gè)未知數(shù)。本研究利用受溢油污染海灘不同時(shí)間序列殘留石油樣品, 通過烷基萘的定量分析, 主要探討：(1) 三甲基萘和四甲基萘各異構(gòu)體在不同時(shí)間序列中的含量水平; (2) 三甲基萘和四甲基萘各異構(gòu)體降解速率變化特征及其與取代基位置、數(shù)量的相關(guān)性。研究結(jié)果不僅是對Ostoji? et al.[11]理論預(yù)測的實(shí)際驗(yàn)證, 同時(shí)對表生環(huán)境中萘系物類多環(huán)芳烴污染的生物修復(fù)效果評價(jià)具有重要指導(dǎo)作用。

1 樣品和實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品背景

原油樣品取自中國大連“七一六”溢油事故所污染的礫石灘, 研究人員[13]發(fā)現(xiàn)此殘留礫石灘時(shí)離“七一六”溢油事故已有34天, 為了獲得一組自然降解序列, 該礫石灘被要求繼續(xù)保留近兩個(gè)月, 分別在發(fā)現(xiàn)后的第0天、3天、15天、32天和52天采集殘留溢油樣品, 并將其帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍處理待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

分別對第0天、3天、15天、32天和52天殘留溢油樣品用二氯甲烷浸泡, 并過無水硫酸鈉柱以除去水、泥、砂等雜質(zhì), 獲得純凈殘留油。用過量石油醚沉淀獲得瀝青質(zhì)組分, 非瀝青質(zhì)組采用硅膠/氧化鋁層析柱, 依次以石油醚、苯、乙醇作洗脫液,獲得飽和烴、芳烴、非烴三個(gè)組分。

飽和烴和芳烴組分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析, 儀器為Agilent 5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀。色譜柱為彈性石英毛細(xì)柱(Agilent DB-1M, 60 m×0.32 mm×0.25 μm)。升溫程序?yàn)槭紲?0 , ℃恒溫3 min, 然后以3 /min℃的升溫速率升至300 , ℃恒溫30 min。進(jìn)樣口溫度為280 , ℃載氣為氦氣, 流速為1.0 mL/ min,恒速。EI模式, 電離能量為70 eV, 離子源溫度200 ℃。全掃描檢測, 質(zhì)量掃描范圍為 50～550 u。烷基萘異構(gòu)體的鑒定依據(jù)文獻(xiàn)和保留時(shí)間確定[1,4], 用氘代菲內(nèi)標(biāo)定量。

2 結(jié)果和討論

2.1 生物降解作用程度

表生環(huán)境中, 光氧化降解、水洗、揮發(fā)和生物作用對原油中各組分分布均有影響, 導(dǎo)致原油的物理性質(zhì)和化學(xué)組成發(fā)生變化, 但這些過程發(fā)生的機(jī)理有所不同, 使得原油的最終面貌表現(xiàn)出差異性?？紤]到原油低分子量組分的揮發(fā)性, 研究中沒有對萘、甲基萘、二甲基萘作討論(實(shí)際上萘和甲基萘已在檢測限以下)。水洗作用主要是選擇性地溶解親水性有機(jī)化合物, 如芳香烴、極性雜原子化合物等。隨著原油在海灘暴露時(shí)間的增加, 研究樣品中非烴瀝青的含量顯著升高, 揭示水洗作用并不是引起原油組分變化的主要原因(表1)。而光氧化降解過程的最大特點(diǎn)是使原油在量上發(fā)生顯著改變, 但總體烴類色譜特征在光氧化降解前后并不會發(fā)生明顯變化,特別是不會出現(xiàn)生物降解作用所致的 UCM 鼓包。并且與生物降解作用相比, 光氧化降解對烴類化合物的選擇性并不明顯, 同一系列化合物不同異構(gòu)體間分異性較弱。大連“七一六”溢油原始油樣含有完整的正構(gòu)烷烴分布, 以及微弱的UCM分布[14], 而后期所獲得樣品有著強(qiáng)烈 UCM 特征, 表明其生物降解作用占有主導(dǎo)地位。

表1 各個(gè)組分含量百分比和回收率Table 1 Percentage of each component content and recovery

如圖2所示, 海灘發(fā)現(xiàn)原始溢油樣(第0天)顯示出重質(zhì)稠油特征, 正構(gòu)烷烴幾乎消耗殆盡, 氣相色譜質(zhì)譜總離子流圖所揭示飽和烴分布特征優(yōu)勢組分為類異戊二烯烴(姥鮫烷和植烷)和環(huán)烷烴。眾所周知,在輕微至中等強(qiáng)度生物降解過程中, Pr/nC17,Ph/nC18[15–17]可以作為指示參數(shù), 用于判定原油的生物降解程度, 由于樣品中nC17和nC18幾乎全部消失,而姥鮫烷(Pr)、植烷(Ph)保持相對較高的豐度, 即Pr/nC17、Ph/nC18比值趨于無窮大, 說明樣品至少遭受了中等強(qiáng)度的生物降解作用, 根據(jù)Peters et al.[15]對生物降解程度的判別標(biāo)準(zhǔn), 達(dá)到 3級降解程度。隨著溢油樣品在表生環(huán)境暴露時(shí)間的增長, 油組分中飽和烴和芳烴的相對含量明顯變小(表1)。相對于第0天樣品和第52天樣品的飽和烴、芳烴含量分別下降了18.21%和10.57%, 而非瀝青質(zhì)含量則上升了23.72%。飽和烴中類異戊二烯烴姥鮫烷、植烷降解顯著。芳烴組分也開始遭到不同程度的降解, 第 52天后菲和甲基菲的降解率分別為 87.71%和 71.42%,三甲基萘的降解率為 79.24%, 四甲基萘的降解率20.53%(表2)。Fisher et al.[18]在對降解原油、受污染的潮間帶沉積物和海底表層沉積物的生物降解研究中, 采用三甲基萘(TBR = 1,3,6-/1,2,4-TMN)和四甲基萘(TeBR = 1,3,6,7-/1,3,5,7-TeMN)比值作為生物降解程度參數(shù), 發(fā)現(xiàn)在生物降解等級為 3～5級時(shí)三甲基萘比值(TBR)變化顯著, 而四甲基萘比值(TeBR)則在生物降解等級為5～6級時(shí)才有明顯變化。同時(shí),基于三芳甾烷(TAS)的強(qiáng)抗生物降解性, 利用菲與三芳甾烷(P/TAS)的比值[19]和三芳甾烷與芳烴總量(TAS/Aro)的比值[9]也可以用于指示生物降解等級,并且常作為高等級生物降解的指示參數(shù)。如表3和圖3所示, 為TBR、TeBR、P/TAS和TAS/Aro四組生物降解參數(shù)的變化趨勢, TAS/Aro和TeBR變化很小, 而 TBR和 P/TAS隨降解時(shí)間推移變化很大。TAS/Aro曲線較為平穩(wěn)說明, 樣品尚未遭受劇烈生物降解, 三芳甾烷沒有實(shí)質(zhì)性消耗, TeBR的微量變化確定了樣品總體的生物降解程度不超過5級。

2.2 生物降解作用過程中烷基萘異構(gòu)體的分布特征

稠環(huán)芳烴的生物降解作用在很大程度上取決于其分子結(jié)構(gòu), 包括化合物的芳環(huán)數(shù)量, 取代基數(shù)量和位置[20]。三甲基萘和四甲基萘異構(gòu)體的芳環(huán)結(jié)構(gòu)相同(同為萘環(huán)), 所以烷基取代基數(shù)量和位置對其生物降解起主要作用。已有研究表明, 烷基萘同系物的取代基數(shù)量越多, 其生物降解抗性越大, 從最易降解到最難降解表現(xiàn)為：二甲基萘 ＞ 三甲基萘 ＞四甲基萘[7–9]。對于有相同數(shù)量取代基的烷基萘, 取代基的位置對其生物降解程度影響重大, 如2,3-DMN和1,8-DMN是抗生物降解能力最強(qiáng)的二甲基萘異構(gòu)體[7], 2,3,6-TMN是最易降解三甲基萘異構(gòu)體之一[9]。

圖 4所示為三甲基萘和四甲基萘分布特征, 發(fā)現(xiàn)在降解過程中, 烷基萘各個(gè)異構(gòu)體均存在著不同程度的變化。圖5所示為烷基萘異構(gòu)體取代基數(shù)量和位置與其生物降解率之間的關(guān)系, 總體上可以觀察到三甲基萘和四甲基萘降解率隨時(shí)間推移而增大的趨勢。由圖5可知, 四甲基萘在前15天的生物降解作用比較小, 三甲基萘異構(gòu)體的降解速率明顯高于四甲基萘異構(gòu)體, 揭示取代基數(shù)量相對少的烷基萘異構(gòu)體受生物降解影響較大。同時(shí), 在三甲基萘和四甲基萘中, 各異構(gòu)體 α位取代基數(shù)量越多, 對生物降解抗性越大, β位取代基數(shù)量越多, 對生物降解敏感性越強(qiáng), 與Ostoji? et al.[11]計(jì)算獲得的三甲基萘異構(gòu)體平均極化率順序一致。三甲基萘異構(gòu)體對生物降解的敏感性程度由大到小為：β,β,β- ＞ α,β,β- ＞α,α,β-TMNs, 四甲基萘異構(gòu)體則表現(xiàn)為：β,β,β,β- ＞α,α,β,β- ＞ α,α,α,β- TeMNs, 較好地反映了烷基萘生物降解作用程度與其取代基位置的相關(guān)性。

由圖 6可見, 無論是三甲基萘還是四甲基萘,其主要降解過程均發(fā)生在 0～32天, 在這之后的 20天中幾乎不發(fā)生顯著變化, 生物降解率趨于平穩(wěn)。暴露32天后, 三甲基萘各異構(gòu)體對生物降解作用的敏感程度由強(qiáng)到弱的表現(xiàn)為：2,3,6-、1,2,7-、1,3,7- ＞1,3,6- ＞ 1,2,5- ＞ 1,6,7-+1,2,6- ＞ 1,3,5-+1,4,6- ＞ 1,2,4-三甲基萘, 而至第15天時(shí), 則敏感度差異性更為顯著: 1,2,7- ＞ 2,3,6- ＞ 1,3,7- ＞ 1,3,6- ＞ 1,2,4- ＞1,3,5-+1,4,6- ＞ 1,6,7-+1,2,6-、1,2,5-三甲基萘(圖 6a)。在這一降解階段, 1,3,7-、1,2,5-、1,6,7-+1,2,6-TMNs降解速率相對穩(wěn)定或呈下降趨勢, 而1,2,4-、1,2,7-、1,3,5-+1,4,6-TMNs的降解速率明顯升高, 導(dǎo)致上述現(xiàn)象的原因可能是1,2,5-TMN和1,6,7-+1,2,6-TMNs存在鄰位取代基會使異構(gòu)體的空間位阻增加而不易被細(xì)菌攻擊; 而1,2,4-TMN中雖然有存在兩個(gè)α位取代基和鄰位取代基, 但是由于該異構(gòu)體中存在一個(gè)未被取代的環(huán), 增加了細(xì)菌攻擊機(jī)率[7], 破壞異構(gòu)體結(jié)構(gòu); 1,3,5-+1,4,6-TMNs的結(jié)構(gòu)有兩個(gè)α取代基, 且無鄰位取代, 故而相對于 1,2,5-TMN和1,6,7-+1,2,6-TMNs其空間位阻較小, 降解速率較高。令人不解的是, 1,2,4-TMN降解速率在32天后逐漸下降, 可能在生物降解過程中存在緩慢輕微的甲基化過程[4], 易生成鄰位和對位取代基異構(gòu)體,但是, 其成因還有待討論。

圖2 飽和烴(a)和芳烴(b)總離子流圖Fig.2 The total ion chromatograms of saturated hydrocarbons (a) and aromatic hydrocarbons (b)

表2 類異戊二烯烴、烷基萘、菲和烷基菲化合物含量(μg/mg)Table 2 Content of isoprenoids, alkyl naphthalene, phenanthrene, and alkyl phenanthrene compounds

表3 生物降解參數(shù)Table 3 Parameters of biodegradation

同等條件下, 四甲基萘與三甲基萘相比, 生物降解率較低(圖 6b), 由于樣品遭受的生物降解等級為 3～5級, 四甲基萘生物降解參數(shù)(TeBR)變化并不明顯, 導(dǎo)致四甲基萘各個(gè)異構(gòu)體的生物降解趨勢相對一致。樣品在暴露 3天后, 四甲基萘各個(gè)異構(gòu)體的降解順序(從大到小)為: 1,2,3,7- ＞ 1,3,6,7-、1,3,5,7-、2,3,6,7- ＞ 1,2,3,6- ＞ 1,2,5,6-+1,2,3,5-、1,2,6,7-、1,2,5,7- ＞ 1,2,4,6-+1,2,4,7-+1,4,6,7-TeMNs,而到第15天時(shí), 1,3,5,7-TeMN降解率明顯高于其他異構(gòu)體, 至52天時(shí), 能明顯看出α取代數(shù)量較多的異構(gòu)體降解率較低。1,2,3,7-TeMN優(yōu)先降解的原因可能是其本身內(nèi)能較低并且7號位置是烷基取代基的三號位和五號位的重合位置, 使其反應(yīng)活性較高[4],更容易遭到生物攻擊所致, 但其優(yōu)先降解原因仍值得探討。

2.3 烷基萘生物降解作用控制因素

從本質(zhì)上講, 表生環(huán)境條件和烷基萘異構(gòu)體結(jié)構(gòu)這兩個(gè)因素制約著烷基萘的生物降解程度, 其中外部環(huán)境的溫度和鹽度、pH值等因子是生物降解的先決條件。Bernard et al.[21]認(rèn)為高鹽度油源中低于80 ℃條件下有利于生物降解, 并隨著溫度的升高生物降解程度減小。Yuan et al.[22]在烷基菲降解中,研究了外部環(huán)境對樣品生物降解的影響, 發(fā)現(xiàn) 30 ℃條件下, pH = 6～8的情況下, 烷基萘的生物降解速率較高。本研究樣品采集實(shí)驗(yàn)區(qū)域?yàn)楹Ｋ疀_刷不到的潮上帶溢油污染區(qū), 相對干燥且土壤鹽度較高, 采集季節(jié)為八月, 日平均氣溫 30～32 ℃, 對微生物生長十分有利。

圖3 生物降解參數(shù)變化趨勢Fig.3 The trends of biodegradation parameters

圖4 生物降解原油中三甲基萘(TMNs) (a)和四甲基萘(TeMNs) (b)分布特征Fig.4 The distribution of trimethylnaphthalenes (TMNs) (a) and tetramethylnaphthalenes (TeMNs) (b) in biodegraded oil

圖5 三甲基萘(TMNs)和四甲基萘(TeMNs)取代基位置和數(shù)量與其生物降解率關(guān)系Fig.5 The relationship between substituent position and number of trimethylnaphthalenes (TMNs) and tetramethylnaphthalenes (TeMNs)and their biodegradation rates

在合適的表生環(huán)境中, 烷基萘的生物降解程度取決于其自身化學(xué)結(jié)構(gòu)特性, 對其生物降解作用起到?jīng)Q定性作用, 表現(xiàn)為以下4個(gè)方面: (1) 取代基數(shù)量較多的烷基萘化合物對生物降解抗性較強(qiáng), 由圖5可知, 三甲基萘生物降解速率明顯高于四甲基萘,與前人[7–9]研究發(fā)現(xiàn)烷基萘的生物降解速率趨勢相符(從最易降解到最難降解)—— 二甲基萘 ＞ 三甲基萘 ＞ 四甲基萘; (2) 在取代基數(shù)量相同的情況下,鄰位取代會導(dǎo)致烷基萘分子空間位阻增大, 會導(dǎo)致化合物不易被生物降解, 如圖6所示, 1,2,5-TMN和1,6,7-+1,2,6-TMNs存在鄰位取代基會使異構(gòu)體的空間位阻增加而不易被細(xì)菌攻擊; (3) 若烷基取代基都分布在同一環(huán)上, 另一個(gè)未被取代的環(huán)會遭受細(xì)菌攻擊而被降解[4], 如1,2,4-TMN, 同環(huán)取代會導(dǎo)致整個(gè)烷基萘分子極化程度增加, 增加了細(xì)菌攻擊未取代環(huán)的幾率; (4) 烷基萘α位取代比β位取代抗生物降解能力更強(qiáng)。萘分子中的α位比β位的碳原子電子云密度高, α位取代基與其相鄰碳原子上的氫原子間距較小, 空間位阻較大[23], 導(dǎo)致α取代烷基萘不易遭到細(xì)菌攻擊, 由本研究可知, 三甲基萘表現(xiàn)為: β,β,β- ＞ α,β,β- ＞ α,α,β-TMNs, 四甲基萘異構(gòu)體則表現(xiàn)為: β,β,β,β- ＞ α,α,β,β- ＞ α,α,α,β-TeMNs,印證了α取代比β取代烷基萘抗生物降解能力更強(qiáng)[4]這一觀點(diǎn)。因此, 表生環(huán)境現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)較好地再現(xiàn)了烷基萘的取代基數(shù)量和位置共同影響其分子空間位阻和極化程度, 控制著烷基萘異構(gòu)體的生物降解作用效率。

圖6 三甲基萘(a)和四甲基萘(b)生物降解率與時(shí)間關(guān)系Fig.6 The variation in biodegradation rates of trimethylnaphthalenes (a) and tetramethylnaphthalenes (b) with time

3 結(jié) 論

烷基萘異構(gòu)體的生物降解作用是多種因素共同控制的結(jié)果, 包括取代基數(shù)量和位置。取代基數(shù)量越多抗生物降解能力越高, 即(從最容易降解到最難降解)三甲基萘 ＞ 四甲基萘。而擁有相同取代基數(shù)量的烷基萘, 其降解規(guī)律與取代基位置有關(guān)。根據(jù)對三甲基萘、四甲基萘的生物降解作用分析, 得知1,2,7-三甲基萘(αββ 取代)、2,3,6-三甲基萘(βββ 取代)、2,3,6,7-四甲基萘(ββββ 取代)、1,2,3,7-四甲基萘(αβββ 取代)和 1,3,5,7-四甲基萘(αβαβ 取代)的降解效果顯著, 這可以說明, 生物降解程度與化合物空間位阻有關(guān), 即 β取代較多且空間位阻小的烷基萘異構(gòu)體易降解。

感謝浙江大學(xué)地球科學(xué)系謝柳娟博士在實(shí)驗(yàn)過程中的指導(dǎo)和幫助。感謝審稿者提出的意見和建議,提高了文章的質(zhì)量。

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