孟彥，肖漢兵，田海峰，胡喬木

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北 武漢 430223；2.中國水產科學研究院淡水漁業(yè)中心，江蘇 無錫 214081)

熱休克/應激蛋白(heat shock/stress proteins，HSPs)是廣泛存在于原核和真核生物細胞中的一類與機體應激反應相關的蛋白質。該蛋白在正常生理機能下有組成型表達，在受熱或其他外界環(huán)境因子(重金屬、病原體、一氧化氮、激素、微生物和抗體)刺激下可被誘導表達[1]。根據同源性和相對分子質量大小，HSPs可以分為HSP110、HSP90、HSP70等不同家族，其中HSP70指相對分子質量約為70 000的家族，是最保守、最主要的一類HSPs，它主要可以分為2種：一種是誘導型HSP70，正常狀態(tài)下在細胞中不表達或少量表達，但在熱應激或其他應激原刺激下表達量迅速增加；另一種為組成型HSC70(heat shock cognate 70)，又稱熱休克同源蛋白，其通常在細胞內有組成型表達，并且能被外界刺激所誘導[2]。通常情況下，HSC70以分子伴侶形式參與蛋白折疊、運轉，多肽組裝，恢復錯誤折疊等生命過程[3]。隨著研究的深入，更多結果表明HSC70還可以作為一種激活因子，介導機體的免疫識別系統(tǒng)，能將結合的多肽遞呈給主要組織相容性復合物(MHC)，激活細胞毒性T細胞產生免疫反應[4]，在生物體抗逆和抗感染方面有重要作用[1]。基于對其功能的逐步認知，多種水生動物的hsc70 基因被克隆，比如青鳉、南方鯰、黃顙魚、大菱鲆和泥鰍等，而且開展了對其抗逆和抗感染作用的相關研究[1]。

大鯢(Andrias davidianus)是中國重要的水生野生動物，也是新興的名優(yōu)養(yǎng)殖水產品。大鯢分子生物學的相關研究較少，尤其是功能基因方面，僅見少數(shù)關于免疫和生長相關基因的研究[5–7]。筆者對大鯢hsc70 基因cDNA全長進行克隆、對其序列進行進化分析，同時研究其在大鯢不同組織中的表達特征，以期為進一步探討大鯢hsc70 可能在免疫機理及應用等方面的作用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試大鯢

3尾變態(tài)后健康大鯢來源于中國水產科學研究院長江水產研究所實驗基地，實驗室內暫養(yǎng)14 d后用MS–222(Sigma)進行麻醉取樣。取腎臟、腦、肺、皮膚、肝臟、胃、脾臟、心臟、肌肉和垂體組織，置于液氮中保存。所有操作按照中國動物保護協(xié)會的標準執(zhí)行。

1.2 總RNA 提取及第一鏈合成

大鯢組織樣品研磨后用Trizol(Invitrogen)提取總RNA，用分光光度計(Eppendorf Biometer，Germany)檢測RNA質量。以此RNA為模板，利用反轉錄試劑盒RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0 (TaKaRa，Japan)合成cDNA第一鏈(具體操作見說明書)，–20℃保存、備用。

1.3 hsc70 基因中間序列的克隆

對GenBank 中收錄的已知物種hsc70 基因的cDNA 序列進行同源比對，在相對保守區(qū)域設計引物P1(5′–AATGAATCCCACGAACACTG–3′)和P2 (5′–ACACCTGAATCAAGACTCCA–3′)，以cDNA第一鏈為模板進行PCR 擴增，25 μL 反應體系，包含2.5 μL 10×PCR Buffer，2.5 μL MgCl2(25 mmol/L)，1 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，10 mmol/L 引物各0.5 μL，0.3 μL Taq 酶(5 U/μL)和 l μL cDNA 模板，ddH2O 16.7 μL。擴增條件為94℃預變性5min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1min，35個循環(huán)，72℃終延伸10min。PCR 產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒( AXYGEN)回收純化，連接到pMD–18T 載體(TaKaRa)，再轉入大腸桿菌DH5a 感受態(tài)細胞，挑選克隆菌送測序。引物合成和測序均在上海生工生物有限公司進行。

1.4 hsc70 基因cDNA 末端的克隆

根據測序后的hsc70基因中間保守序列，設計并合成用于進行3′RACE和5′RACE特異性末端擴增的引 物P3R(5′–CTGTTACTTGATGTCACCCC–3′) 和P5R(5′–GGTCAGCATTCAGCTCCTCAAAAC–3′)。利用試劑盒SMART RACE cDNA Amplifieation Kit (Clontech)和Advantage 2 PCR Kit(Clontech)擴增得到大鯢hsc70基因cDNA末端序列。擴增產物按上述方法回收、純化、克隆后送上海生工生物有限公司測序。

1.5 序列分析

利用序列拼接軟件SeqMan(DNASTAR6.0)將測序后的中間保守序列、3′RACE和5′RACE末端序列進行拼接，獲得大鯢hsc70基因的cDNA全長序列。序列同源性比對利用NCBI在線工具(www.ncbi.nlm. nih.gov/blast)進行，另外利用在線工具進行開放閱讀框(ORF)、相對分子質量、等電點、疏/親水性分析。蛋白預測分析使用ExPASy在線軟件(http://www. expasy.org/tools/)進行；利用Mega 5.0軟件將大鯢hsc70基因編碼的氨基酸(AA)與選擇的NCBI中部分已知物種hsc70氨基酸序列做Clustal W比對并構建進化樹。選擇物種包括人(Homo sapiens，Hs，NP_ 006588.1)、褐家鼠(Rattus norvegicus，Rn，NP_ 077327.1)、牛(Bos taurus，Bt，NP_776770.2)、中華鱉(Pelodiscus sinensis，Ps，NP_001273837.1)、鈍口螈(Ambystoma mexicatnum , Am，AAK31583.1)、非洲爪蟾(Xenopus laevis，Xl，NP_001080068.1)、白鰱(Hypophthalmichthys molitrix，Hm，ADH 15624.1) 、 小 體 鱘(Acipenser ruthenus ， Ar ，AEK81529.1)、泥鰍(Misgumus anguillicaudatus，Ma，AFW97631.1)和草魚(Ctenopharyngodon idella，Ci，ADX32515.1)。

1.6 hsc70 的半定量PCR

根據大鯢hsc70基因全序列，設計半定量PCR引物Hsc70–F1(5′–ATCTTGGCACCACCTACTCCT–3′)和 Hsc70–R1(5′–CAAAGACAGTGTTCGTGGGAT –3′)，擴增該基因約177 bp的序列片段。以大鯢β–actin基因(序列號HQ822274)為內參，利用軟件Primer 5.0 設計半定量PCR引物β–actin F1(5′–TGA TGGTTGGTATGGGACAGAA–3′)和β–actin R1(5′– CTCTTCTGGGGCAACACGGA–3′)。在S1000PCR 儀(BIO–RAD)中進行PCR反應，體系為25 μL，其中包 含10×PCR Buffer 2.5 μL，1 μL dNTPs(10 mmol/L)、上下游引物各1 μL(10 mmol/L)，1 μL Taq酶(5 U/μL)和 l μL cDNA模板，ddH2O 17.5 μL。其中模板為健康大鯢不同組織的cDNA第一鏈。反應條件為94℃預變性5min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃終延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 大鯢hsc70 基因序列分析

采用RT–PCR和RACE技術克隆到大鯢hsc70基因cDNA序列全長為2 284 bp，其中3′端和5′端非翻譯區(qū)分別為87 bp(1～87)和253 bp(2 032～2 284)，中間序列即編碼區(qū)長1 944 bp(88～2 031)，編碼647個氨基酸(AA)；G+C含量為46%，A+T含量為54%，在3′端非翻譯區(qū)的Poly(A)尾巴上游有典型的真核細胞加尾信號(AATAAA)。GenBank登錄號為HM998289。預測編碼蛋白的相對分子質量約為70 748.8，理論等電點(PI)為5.27，分子式為C3104H4985N855O995S17。蛋白在水溶液中280 nm處的摩爾消光系數(shù)為33 600 mol/(L·cm)，不穩(wěn)定系數(shù)為35.4，不穩(wěn)定系數(shù)小于40，說明該基因表達的蛋白屬于穩(wěn)定蛋白，并且親水/疏水指數(shù)分析結果表明為親水性蛋白。該核苷酸序列與已知兩棲類的熱休克同源蛋白70的同源性在80%左右，如與鈍口螈(Ambystoma mexicatnum)的同源性為83.5%，與萊桑池蛙(Rana lessonea)的同源性為80.8%，與其他物種的同源性則相對較低。將其翻譯為氨基酸序列進行比對，結果發(fā)現(xiàn)，該基因的AA序列具有熱休克蛋白家族序列標簽IDLGTTYSCV和IVLVGGSTRIPKIQK區(qū)，分別位于AA序列9–18和334–348位的氨基酸殘基，并且在其C′端有熱休克蛋白GGMP四肽簡單重復序列(615–622位)，表明所克隆的序列屬于熱休克蛋白70家族基因。

2.2 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化樹構建

將克隆到的hsc70 基因編碼區(qū)翻譯成AA 后在NCBI 中進行tblastn 序列比對，發(fā)現(xiàn)其與鈍口螈(Ambystoma mexicanum，Am，GI：13242237)的AA序列相似性為94%，與其他已知物種的相似性在90%左右。在NCBI 中選擇部分已知物種hsc70 氨基酸序列，與大鯢hsc70 編碼AA 比對并構建系統(tǒng)進化樹。

從圖1 中可以看出，該基因的AA 序列與分類地位最近的鈍口螈差異最小，與其他物種的AA 序列存在較大差異，尤其在54、87、146 和501 氨基酸位點處，大鯢hsc70 在這4個位點編碼的氨基酸分別為P(脯氨酸)、G(甘氨酸)、S(絲氨酸)、S(絲氨酸)，而其他物種則為A(丙氨酸)、K(賴氨酸)、T(蘇氨酸)和M(甲硫氨酸)。

圖1 大鯢hsc70 基因AA 序列與其他物種比對結果 Fig.1 The AA sequence aligning of hsc70gene with other species

基于AA 比對結果，構建不同物種hsc70 基因的Neighbor–Joining(NJ)和Minimum–Evolution(ME)系統(tǒng)進化樹，得到相似的聚類結果，圖2 為利用NJ 方法構建的進化樹。聚類結果顯示，大鯢hsc70基因先與同屬于有尾兩棲類的鈍口螈聚在一起，然后再與非洲爪蟾聚為一小類，而哺乳類的牛、人和褐家鼠聚為一起，中華鱉處于上述兩個進化小單位的中間類型。魚類則形成一個大的聚類群。這些進化關系與其分類關系基本一致，說明hsc70 基因在進化上同生物進化是同階進行的。

將圖2 所列11個物種的hsc70 基因cDNA 和AA 序列長度與斑馬魚的相比較，結果表明，這12個物種cDNA 序列長度在2 130 bp(褐家鼠)和2 770 bp(斑馬魚)之間；但12個物種的hsc70 基因cDNA的AA 序列的長度在646(福家鼠)～658(斑馬魚)之間，說明物種間hsc70 基因的cDNA 中間部分序列長度相當保守，而3′端和5′端非翻譯區(qū)的序列片段長度差異較大。

圖2 基于NJ 法構建的hsc70 基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹 Fig.2 The phylogenetic tree based on amino acid sequences of hsc70gene by NJ method

2.3 hsc70 基因在組織中的表達

以大鯢β–actin 基因為內參，利用半定量PCR方法檢測大鯢hsc70 在正常狀態(tài)下的組織表達情況。檢測結果見圖3。hsc70 基因在10 種組織內都以較高的水平表達，但仍然存在組織差異：在腎臟、腦、肺、皮膚、肝臟、腎臟、脾臟中表達量相對較高，在肌肉和垂體中則較低。這些表達特征與hsc70基因在草魚[8]、凡納濱對蝦[9]、泥鰍[10]等物種的表達特征基本類似。但巖原鯉hsc70 基因在肌肉中的表達豐度大[11]，這與草魚、泥鰍以及大鯢的不同，說明不同物種中hsc70 基因的表達有差異。

圖3 大鯢hsc70 半定量PCR 檢測結果 Fig.3 Relative quantification PCR results for hsc70 in normal tissues of Chinesegiant salamander

3 討 論

本研究克隆了大鯢的hsc70 基因cDNA 的序列全長2 284 bp，發(fā)現(xiàn)其與已知部分物種hsc70 基因cDNA 核苷酸序列片段差異較大，但編碼的AA 數(shù)目在658～646，說明hsc70 基因cDNA 序列長度和其編碼蛋白的AA個數(shù)沒有明顯的相關性，核苷酸長度差異主要在3′端和5′端非翻譯區(qū)。大鯢hsc70基因編碼蛋白的AA 序列與鈍口螈同源性最高(97.1%)，與牛、鼠等的同源性也達到95%左右。這說明hsc70 基因編碼的蛋白在物種間比較保守，這與其在整個進化史上是一個古老且保守的結論是一致的[2]。但是編碼氨基酸也存在一定的變異，特別是在54、87、146 和501 氨基酸位點上，大鯢與其他物種的氨基酸完全不同，進一步分析表明大鯢在這4個位點的突變可能存在物種進化上的正選擇作用。正選擇是指生物在進化過程中將含有發(fā)生了有利突變固定下來的選擇作用，是生物對自然界的一種適應性突變，這種突變尤其在與抗逆等相關的基因上表現(xiàn)較多[12]。大鯢作為一種古老的物種，處在水生動物向陸生動物過渡的階段，hsc70 也屬于抗逆相關蛋白基因，但該四個位點的突變是否是一種適應性的正選擇還有待于進一步研究驗證。利用該基因的AA 序列構建進化樹，結果表明，基因的聚類關系與物種的分類地位是相關的，如泥鰍、白鰱、草魚聚在一類，而兩棲類的鈍口螈、大鯢、非洲爪蟾聚在一起，哺乳類的牛、人和褐家鼠聚在一起。

對大鯢hsc70 基因在腎臟、腦、肺、皮膚、肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肌肉和垂體10 種組織的表達情況分析結果顯示，盡管hsc70 基因在10 種組織內表達豐度都較高，但仍有組織差異：垂體和肌肉表達量最少，脾臟次之，腎臟、皮膚等組織豐度最高。這些結果與其他魚類的結果不完全相似。例如hsc70 在草魚腎臟、鰓的表達量最高，而在肌肉、小腸等表達量低[8]。在泥鰍的腸、鰓及肝組織內hsc70 基因以較高量表達，而在肌肉、心臟則微量表達[10]。這些都表明作為一種廣泛存在于真核和原核動物中的保守基因，hsc70 基因表達有組織普遍性，但同時也有一定的特異性。

盡管熱休克蛋白最早是在熱或者光毒性壓力刺激下產生而命名的[13]，但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其在動物免疫方面也發(fā)揮一定的作用。魚類和甲殼動物熱休克同源蛋白的免疫作用已有報道，該基因對蝦感染白斑綜合癥過程中抵制細胞凋亡所必須的[14]；在草魚中其可以促進免疫系統(tǒng)行使免疫應答反應[8]，而在近江牡蠣被溶藻弧菌感染后，該基因高度表達，參與了機體抗病原感染的相關過程[15]。目前大鯢疾病頻發(fā)[16–17]，成為制約大鯢養(yǎng)殖的主要因素之一。為了對大鯢病害防治提供研究基礎，促進大鯢養(yǎng)殖業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展，下一步將開展熱休克同源蛋白在大鯢疾病和免疫相關方面的研究。

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