李曉梅, 包馨慧， 楊毅寧, 馬依彤, 陳邦黨， 劉 芬， 李海霞

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心， 烏魯木齊 830054)

2003年Zhao等[1]首次提出缺血后適應(yīng)(Ischemia postconditioning，IPost)概念，它是一種在再灌注早期，通過快速、反復(fù)、短暫中斷冠脈血流后，再完全恢復(fù)心肌灌注，而起到明顯減少心肌梗死范圍、抗再灌注心律失常及抗心肌細(xì)胞凋亡等減輕再灌注損傷、保護(hù)心肌的有效可行的方法[2-3]。目前多項研究顯示IPost是減輕急性心肌梗死再灌注損傷可行和最為有效的治療措施，有著極大的臨床應(yīng)用價值，已成為目前的研究熱點[4]。缺血再灌注損傷目前大部分在器官及整體動物水平如離體心臟灌流、活體動物模型上等進(jìn)行，尤其是國內(nèi)，尚未見在細(xì)胞水平上建立缺血后適應(yīng)模型進(jìn)行相關(guān)的實驗研究報道。本研究進(jìn)行體外培養(yǎng)新生SD乳鼠心肌細(xì)胞，擬在細(xì)胞水平建立心肌細(xì)胞缺血后適應(yīng)模型，評價心肌細(xì)胞缺血后適應(yīng)模型對心肌細(xì)胞再灌注損傷的影響，為缺血性心臟病的研究及治療提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物、試劑與儀器選取出生1～3 d的SD乳鼠20只,雌雄不限(由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。DMEM培養(yǎng)基(GIBCO),小牛血清(GIBCO),胰酶(GIBCO)，Ⅱ型膠原酶(GIBCO)，Brdu-5(Sigma)，Hochest33342試劑盒(Sigma),Bcl-2及Bax抗體(Santa，美國)。

1.2心肌細(xì)胞培養(yǎng)取SD大鼠心臟,Hanks液中清洗3～4次,去心包膜及心房，將心室肌切碎，加入用D-Hanks配置的0.05%胰酶和0.08%膠原酶 Ⅱ 的混合溶液水浴震蕩消化，每次10 min，共8次，每次吸取上清，吹打分散細(xì)胞，經(jīng)濾網(wǎng)過濾后1 000 r/min離心5 min后用培養(yǎng)液重懸，差速貼壁90 min，加入Brdu后將細(xì)胞密度調(diào)整至(5～6)×105cells/L接種于培養(yǎng)皿中，于5%的CO2、高濕度的培養(yǎng)箱孵育后，24 h后觀察細(xì)胞存活率，培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3體外心肌細(xì)胞缺血后適應(yīng)模型的建立取原代培養(yǎng)第4 天的細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。實驗分正常對照組(SH組)、缺血再灌注組(I/R組)及缺血后適應(yīng)組(IPost組)3組。將培養(yǎng)成功的心肌細(xì)胞置于密閉的管型瓶中，用含5%CO2及95%氬氣的混合氣體置換瓶內(nèi)氣體并持續(xù)30 min，造成心肌細(xì)胞缺氧；缺血再灌注組隨后持續(xù)給予富氧的氣體于瓶內(nèi)孵育細(xì)胞24 h，造成心肌細(xì)胞的再氧和。缺血后適應(yīng)組在再氧和之前給予缺氧1 min+再氧合1 min，共3個循環(huán)的處理。正常對照組一直于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.4細(xì)胞凋亡率的檢測(1)Hoechst33342染色檢測凋亡:將各組心肌細(xì)胞用煙酸己可堿(Hoechst33342)及碘化丙啶(PI)混合溶液染色后在熒光倒置顯微鏡下觀察并測定細(xì)胞凋亡率。 (2) 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：收集各組細(xì)胞，70%乙醇固定，4℃過夜。加PI染液，避光37℃孵育30 min。用流式細(xì)胞儀采集數(shù)據(jù)，結(jié)果用百分比表示。

1.5RT-PCR方法檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)提取的總RNA經(jīng)核酸分析儀測定純度和濃度后，按RT-PCR試劑盒說明書操作，以各自引物擴(kuò)增。反應(yīng)條件: 94℃5 min, 94℃30 s; 55.6℃30 s, 72℃30 s, 35個循環(huán)后，72℃進(jìn)一步延伸7 min。引物設(shè)計依據(jù)文獻(xiàn)[4]中的小鼠心肌組織中cDNA序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。取5 μL PCR產(chǎn)物，于2%瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析，計算各目的基因mRNA與β-actin m RNA的灰度比值。

1.6Western印跡檢測心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)收集細(xì)胞,RIPA裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min,測定蛋白濃度,按50μg/mL蛋白含量配制上樣蛋白樣品。室溫下SDS-PAGE電泳，4℃過夜電轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上，8%脫脂奶粉的封閉液中封閉37℃ 1 h，常規(guī)洗膜封閉，孵育相應(yīng)一抗(一抗以1∶2 000稀釋，GAPDH抗體以1∶3 000稀釋)和二抗(1∶2 000稀釋)，反復(fù)洗膜后，堿性磷酸酶試劑顯色。根據(jù)顏色變化及時終止顯色反應(yīng)。用Quality圖像分析系統(tǒng)對免疫印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析，目的蛋白表達(dá)量以其與內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)條帶的灰度比值表示。

2 結(jié)果

2.1心肌細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果倒置相差顯微鏡下,可見剛分離的心肌細(xì)胞,呈圓形,懸浮于培養(yǎng)液中。2 h后細(xì)胞開始貼壁生長,逐漸伸展為圓形、梭形、棒狀、星狀、三角形、多邊形等形態(tài), 12 h細(xì)胞基本貼壁,少數(shù)貼壁的單個細(xì)胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動,搏動頻率較慢,有的每分鐘僅數(shù)次。24 h后95%的細(xì)胞均有搏動,培養(yǎng)第3 天可形成放射狀排列的細(xì)胞簇,逐漸形成細(xì)胞簇或細(xì)胞單層,可見島嶼樣搏動,呈同步性,形成功能性合體細(xì)胞,搏動頻率80～150次/min(圖1)。

2.1.1 細(xì)胞存活率 錐蟲藍(lán)染色計數(shù)200個細(xì)胞,10個染色陽性,細(xì)胞存活率為95%。

2.1.2 心肌細(xì)胞純度 cTnT標(biāo)記心肌肌鈣蛋白T。心肌細(xì)胞肌鈣蛋白T表達(dá)陽性,呈紅色,位于胞漿; 非心肌細(xì)胞中陰性,鏡下任選10個視野,計數(shù)200個細(xì)胞,陽性細(xì)胞的比率為92%(圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞分離培養(yǎng)48 h照片(×200)

2.2心肌細(xì)胞凋亡率Hoechst33258熒光染色檢測結(jié)果顯示，SH組心肌細(xì)胞凋亡率為7%，I/R組為40%，IPost組為15%(圖3)。流式細(xì)胞技術(shù)檢測結(jié)果顯示， I/R組心室肌細(xì)胞凋亡率為(28.3±2.1)%，較SH組的(6.2±1.0)%顯著增大(P<0.05)；IPost組心室肌細(xì)胞凋亡率為(17.1±2.4)%，雖較SH組增大，但明顯小于I/R組(P<0.05)(圖4) 。

2.3心肌細(xì)胞Bcl-2、BaxmRNA的表達(dá)RT-PCR結(jié)果分析顯示，SH組與I/R組、IPost組均表達(dá)Bcl-2、Bax蛋白,與SH組(0.10±0.010)相比，I/R組(0.34±0.012)與IPost組(0.67±0.019)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高；I/R組Bax(0.57±0.017)較IPost 組(0.43±0.031)mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；IPost組Bcl-2/Bax(1.57±0.014)較I/R組(0.62±0.100)明顯升高(圖5，表1)。

cTnT DAPI Merge

SH組 I/R組 IPost組

SH組 I/R組 IPost組

M ：DNA標(biāo)記物；1和5：陰性對照組： 2：SH組；3：I/R組；4：IPost組

2.4心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)Western-blot結(jié)果分析顯示，SH組與I/R組、IPost組均表達(dá)Bcl-2、Bax蛋白,與SH組(1.23±1.01)相比，I/R組(3.65±1.23)與IPost組(4.01±0.73)Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高；I/R組Bax(3.10±1.27)較IPost 組(2.14±1.01)mRNA表達(dá)明顯上調(diào)；IPost組Bcl-2/Bax(2.01±1.21)較I/R組(1.21±1.01)明顯升高(圖6，表1)。

1： SH組； 2： I/R組； 3：IPost組

表1 各組心肌細(xì)胞Bcl-2和Bax的表達(dá)

注： 與SH組比較，*P<0.05; 與I/R組比較，#P<0.05。

3 討論

再灌注治療是急性心肌梗死最為有效的治療手段，及時有效的再灌注治療是減少梗死面積、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。然而，大量的基礎(chǔ)和臨床研究證實，再灌注治療在挽救存活心肌細(xì)胞的同時，會造成致死性缺血再灌注損傷，抵消急性血運重建帶來的益處，直接影響患者的預(yù)后[5]。尋求一種有效可行的方法減輕心肌缺血再灌注損傷，最大限度保護(hù)缺血心肌和限制心肌梗死范圍，是國內(nèi)外學(xué)者探索的目標(biāo)。

離體培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在結(jié)構(gòu)和功能上保存了體內(nèi)心肌的一些特點,同時又?jǐn)[脫了體內(nèi)各種限制因素對心肌細(xì)胞的影響。因此建立細(xì)胞水平的缺血后適應(yīng)模型將有助于更方便地進(jìn)行缺血再灌注損傷以及缺血后適應(yīng)相關(guān)保護(hù)機(jī)制的研究。此外，與成年心肌細(xì)胞相比，新生大鼠心肌細(xì)胞分離操作簡便,成活率高,存活時間長,應(yīng)用范圍廣泛。建立體外心肌細(xì)胞缺血后適應(yīng)模型對于從細(xì)胞水平研究心肌缺血性疾病發(fā)病機(jī)制及治療具有重大意義。

許多實驗已經(jīng)證實，心肌缺血/再灌注可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，是缺血再灌注組織損傷功能喪失的重要原因。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要途徑，很多細(xì)胞因子能引起線粒體的損傷，其中Bcl-2/Bax能對線粒體產(chǎn)生重要影響[6]。Bcl-2基因家族是目前較為公認(rèn)與凋亡密切相關(guān)的基因。研究表明， Bcl-2/Bax比例是決定細(xì)胞對凋亡刺激信號敏感的重要因素[7-8]。當(dāng)Bcl-2過量時,細(xì)胞免遭凋亡，反之，細(xì)胞易于在誘導(dǎo)劑的作用下發(fā)生凋亡具有正向調(diào)節(jié)作用。Engler等[9]首先報道了細(xì)胞凋亡Bcl-2與心肌缺血再灌注損害有關(guān), 相繼的研究提示在心肌,Bcl-2作為保護(hù)因子抑制含壞死及凋亡的細(xì)胞死亡,從而發(fā)揮提高對缺血耐受性的作用。

本實驗所培養(yǎng)的心肌細(xì)胞純度>90%且活性較好，為研究建立心肌細(xì)胞缺血后適應(yīng)模型奠定了基礎(chǔ)。之前對于心肌缺血后適應(yīng)的研究多是在器官水平(離體心臟)進(jìn)行，并已證實缺血后適應(yīng)能降低心臟的壞死面積，并且能抗心律失常，發(fā)揮抗缺血再灌注損傷的作用[3]。本實驗用心肌細(xì)胞建立缺血后適應(yīng)模型，在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實缺血后適應(yīng)對心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且探討其可能機(jī)制是通過抗心肌細(xì)胞凋亡來實現(xiàn)。本實驗結(jié)果表明與缺血再灌注相比，缺血后適應(yīng)能顯著降低體外心肌細(xì)胞的凋亡率，減少心肌細(xì)胞的缺血再灌注損傷；在此過程中Bcl-2的表達(dá)增加，而Bax的表達(dá)降低，Bcl-2/Bax的比值明顯增加。此結(jié)果提示缺血后適應(yīng)對心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2的表達(dá)、下調(diào)Bax的表達(dá)實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過用離體心肌細(xì)胞建立缺血后適應(yīng)模型，從細(xì)胞水平證實了后適應(yīng)能有效降低心肌細(xì)胞在缺血再灌注中的凋亡，提高心肌細(xì)胞的存活率，并闡明了其機(jī)制可能是通過上調(diào)Bcl-2和抑制Bax的表達(dá)來實現(xiàn)的。至于缺血后適應(yīng)是通過何種途徑引起B(yǎng)cl-2表達(dá)的上調(diào)及Bax表達(dá)下降有待進(jìn)一步研究。

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