耿 晶， 趙東升,， 張海波， 陳 堅(jiān)， 李新霞

(1新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011; 2新疆埃樂欣藥業(yè)有限公司， 烏魯木齊 830013)

大蒜(AlliumSativumL.)為百合科蔥屬多年生草本植物，是歷史悠久的藥食兩用植物[1]?！睹t(yī)別錄》(梁)、《新修本草》(唐)、《古今注》、《普濟(jì)方》、《本草綱目》(明)等古醫(yī)術(shù)中均有記載，指出大蒜具有通五臟、達(dá)諸竅、去寒濕、避邪惡、消臃腫、化積食等功能[2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，大蒜不但具有抗菌[3]、消炎[4]等藥理作用，還具有降血壓[5]、降血脂[6]、抗腫瘤[7]、防止動(dòng)脈粥樣硬化[8]、抑制血小板聚集[9]、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[10]等功效。大蒜經(jīng)壓碎或碾碎后，蒜酶反應(yīng)系統(tǒng)處于激活狀態(tài)，組織細(xì)胞破裂，處在液泡中的蒜酶被釋放出來，催化細(xì)胞質(zhì)中的蒜氨酸裂解產(chǎn)生大蒜辣素，而大蒜辣素極不穩(wěn)定，會(huì)進(jìn)一步分解[11]。大蒜凍干粉是大蒜經(jīng)過冷凍干燥制成的粉末，可保留大蒜的活性成分，可作為大蒜制劑的原料藥。近幾年，國內(nèi)多個(gè)廠家都對(duì)大蒜凍干粉進(jìn)行研究和生產(chǎn)，《英國藥典》、《歐盟藥典》和《美國藥典》對(duì)大蒜粉均有收錄。

本研究依據(jù)高效液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間、峰面積及整個(gè)高效液相色譜指紋圖譜的相似性來進(jìn)行分析，旨在建立大蒜凍干粉高效液相色譜指紋圖譜，采用數(shù)學(xué)分析方法提取與表達(dá)指紋圖譜提供的物質(zhì)群特征成分信息。

1 儀器與試藥

1.1主要儀器高效液相色譜儀(e2695型，美國Waters公司)，紫外檢測(cè)器(2489，美國Waters公司)，分析天平(BS 110 s，d=0.1 mg，德國Sartorius公司)，低溫離心機(jī)(Multifugex-3R，美國Thermo公司)，超聲波清洗儀(200 W，40 KHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥大蒜凍干粉(新疆醫(yī)保公司提供)，甲醇(色譜純，美國sigma公司)，無水甲酸(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，水為屈臣氏蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1供試品溶液制備稱取大蒜粉約0.8 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加水20.0 mL，超聲(冰水浴)5 min，取出，室溫放置30 min，離心(離心力12 000×g，4℃)30 min，移取上清液10.0 mL，置25 mL容量瓶，甲醇-1%無水甲酸水溶液(60∶40)稀釋并定容至刻度，振搖混勻，離心(離心力12 000×g，4℃)5 min，取上清液作為供試品溶液。

2.2色譜條件色譜柱:SHIMADZU VP-ODS色譜柱(4.6 μm × 25 cm)，流動(dòng)相:1%無水甲酸和甲醇梯度洗脫，洗脫程序：0 min →6 min →8 min →12 min →18 min →25 min →28 min →30 min，甲醇10%→30%→35%→35%→50%→80%→10%→10%；流速:1.0 mL/min；檢測(cè)波長:254 nm；柱溫:35 ℃；進(jìn)樣量:10 μL，運(yùn)行時(shí)間：30 min。

2.3共有峰的標(biāo)定根據(jù)典型色譜圖，標(biāo)定出分離良好的色譜峰為共有峰，共9個(gè)(圖1)。

圖1 大蒜凍干粉典型色譜圖

2.4指紋圖譜試驗(yàn)的方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取1份大蒜粉供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，以主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD，考察其精密度。結(jié)果，各個(gè)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間RSD(%)在0.02%～0.22%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD(%)在1.08%～4.73%范圍內(nèi)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批大蒜粉5份，精密稱定，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算RSD，考察方法的重復(fù)性。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD(%)在0.06%～1.66%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD(%)在1.29%～5.97%范圍內(nèi)。結(jié)果表明供試品制備方法的重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同1份大蒜粉供試品溶液，分別在0、0.5、1、2、4、8、12 h進(jìn)樣，以主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積為指標(biāo)分別計(jì)算RSD，考察大蒜藥材供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果，各色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD(%)在0.02%～1.11%范圍內(nèi)，相對(duì)峰面積RSD(%)在0.19%～5.31%范圍內(nèi)。結(jié)果表明大蒜供試品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.5指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)

2.5.1 指紋圖譜及共有峰的標(biāo)定 將10個(gè)批次大蒜凍干粉制成供試品溶液后進(jìn)行測(cè)定，凍干粉中各成分的色譜峰在30 min之內(nèi)出完，應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)))(2004A版)比較10個(gè)批次大蒜凍干粉的色譜圖，其中有9個(gè)色譜峰是共有的，確定為共有峰(圖1)，10個(gè)批次大蒜凍干粉指紋圖譜比較見圖2。

2.5.2 共有峰的保留時(shí)間及峰面積 10個(gè)批次大蒜凍干粉共有峰保留時(shí)間差異較小，峰面積差異較大，說明10個(gè)批次凍干粉成分含量有差別(表1、2)。

圖2 大蒜凍干粉指紋圖譜

表1 不同批次大蒜凍干粉共有峰保留時(shí)間

表2 不同批次大蒜凍干粉共有峰峰面積

2.5.3 相似度評(píng)價(jià)結(jié)果 應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)))(2004A版)[12]對(duì)10個(gè)批次大蒜凍干粉的色譜圖進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，其相似度均>0.96，說明不同批次大蒜凍干粉化學(xué)組成一致性較好。10個(gè)批次大蒜凍干粉相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見表3。

3 討論

指紋圖譜是中藥液相色譜圖譜的特征峰色譜，能夠反映中藥材整體的化學(xué)信息，目前是比較科學(xué)的控制中藥材質(zhì)量的可行策略。因此，對(duì)大蒜凍干粉HPLC指紋圖譜進(jìn)行研究，旨在有效地控制大蒜凍干粉的質(zhì)量。

本研究參考本課題組自建大蒜藥材含硫化合物類物質(zhì)群HPLC的色譜條件，建立了的指紋圖譜，色譜峰分離良好，并指認(rèn)出6號(hào)峰為大蒜公認(rèn)活性物質(zhì)——大蒜辣素峰，基線平穩(wěn)，信息量豐富，峰的數(shù)目、強(qiáng)度較為理想(圖1)，幾乎可以呈現(xiàn)大蒜凍干粉化學(xué)成分的全貌，并經(jīng)過方法學(xué)的驗(yàn)證，結(jié)果符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

表3 不同批次大蒜凍干粉相似度

從不同批次色譜圖(圖2)來看，色譜圖概貌一致，經(jīng)相似度分析評(píng)價(jià)(表3)，其相似度均>0.96，說明不同批次化學(xué)組成一致性較好，但是不同批次共有峰峰面積差異較大，表明所含成分的含量有差異。

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