李 慧, 李秀娟， 古力熱巴·夏依買旦， 阿曼古麗·如則， 吳 江, 聶永梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室, 烏魯木齊 830011; 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室, 烏魯木齊 830011;3第二附屬醫(yī)院心電圖室, 烏魯木齊 830063)

血管內(nèi)皮細胞分布于全身各組織器官，傳統(tǒng)認為其功能是促進水及小分子物質(zhì)交換,是位于血液與間質(zhì)組織間的一層半透性屏障。近年來發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞可分泌多種生物活性物質(zhì)通過進入循環(huán)、旁分泌或自分泌等方式作用于靶細胞，對機體進行調(diào)節(jié)。血管內(nèi)皮細胞功能障礙的發(fā)展后果已成為血管性疾病關(guān)注的熱點[1-2]。細胞實驗已經(jīng)成為不可或缺的研究方法。相關(guān)的疾病主要有高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化及腫瘤惡化[3]。對血管內(nèi)皮細胞功能的研究常用的是臍靜脈內(nèi)皮細胞，主要有原代臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)和EA.HY926人臍靜脈內(nèi)皮細胞株。本實驗在建立原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞體外分離和培養(yǎng)方法的同時，比較原代人臍靜脈內(nèi)皮細胞與 EA.HY926人臍靜脈內(nèi)皮細胞株的生物特性，為血管性疾病研究的細胞來源的選擇提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1材料原代細胞：來源于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦分娩后所取的新生胎兒臍帶，長度15～20 cm。EA.HY926人臍靜脈內(nèi)皮細胞株來自上海細胞庫。

1.2試劑M199培養(yǎng)基(Hyclone 美國)，胎牛血清(Gibco 美國)，內(nèi)皮細胞生長因子(ECGS Millipore)，Ⅱ型膠原酶(Worthington 美國)，胰酶(Biosharp)，雙抗/青鏈霉素合劑(Gibco 美國)，內(nèi)皮細胞Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化試劑盒(中杉)，PBS液(自配)，MTT(自配)。

1.3方法

1.3.1 EA.HY926細胞株的培養(yǎng)方法 按細胞數(shù)>1×105個/mL接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，M199生長液(含10%的胎牛血清、1%青鏈霉素合劑、肝素的M199培養(yǎng)基)培養(yǎng)，置于5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，24 h后取出觀察細胞生長。

1.3.2 原代細胞培養(yǎng)方法 無菌條件下取健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦分娩的新生兒臍帶(離體時間<4 h)，長度15～20 cm，在超凈臺內(nèi)用D-Hanks 液沖洗臍帶表面，去除臍帶兩端約0.5 cm的易污染及血腫部分以便分清臍靜脈;立即用含1%雙抗的PBS液沖洗臍靜脈管腔至無肉眼血色。向管腔灌注Ⅱ型膠原酶后用止血鉗封閉臍帶的兩段，置37℃培養(yǎng)箱中消化18 min，其間按壓臍帶2～3次，使血管壁上的內(nèi)皮細胞徹底消化下來，加生長液[含 20%的胎牛血清、1%青鏈霉素合劑、25%的內(nèi)皮細胞生長因子(ECGS)和肝素的M199培養(yǎng)基[4]]終止消化后收集細胞至50 mL離心管中， 1 000 r/min離心5 min。棄去上清液，加入2 mL的生長液使細胞重懸并計數(shù),要求>1×106個/mL。移至25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加生長液到4 mL，移至培養(yǎng)箱后立即水平十字架搖動培養(yǎng)瓶使細胞均勻貼壁。靜置培養(yǎng)48 h后換液1次，之后每2～3天換液1次。顯微鏡下觀察細胞的生長狀況, 2～3 d后可傳代[5]。

1.3.3 原代細胞及EA.HY926細胞株的鑒定 (1)倒置顯微鏡形態(tài)學(xué)鑒定：細胞長滿以后，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)并照相。(2)透射電鏡形態(tài)學(xué)鑒定：透射電子顯微鏡觀察內(nèi)皮細胞超微結(jié)構(gòu)及內(nèi)皮細胞特異性Webel-Palade小體。(3)Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化檢查：第2代或第3代的內(nèi)皮細胞按1×105個/mL的濃度種植在35 mm的培養(yǎng)皿中，待細胞生長融合以后，用ABC法進行免疫組化染色，觀察及照相;蘇木素染色以后觀察及照相，不同批次的細胞重復(fù)5次，用Image-Pro Plus 6.0軟件進行平均光密度評分，結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。(4)細胞增長曲線的繪制：分別取對數(shù)生長期細胞，將細胞按一定密度(最終濃度：原代細胞為1.6×104個/mL，細胞株為2.5×105個/mL)接種于96孔細胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，24 h后每孔加入MTT(200 μL/孔),37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，小心吸去上清，每孔加入二甲基亞砜150 μL，振搖10 min，在酶標(biāo)儀490 nm吸光值的條件下測OD值，連續(xù)測6 d，以O(shè)D值繪制曲線。

2 結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察比較EA.HY926細胞株有類管腔樣結(jié)構(gòu)形成，但細胞形態(tài)單薄，胞內(nèi)顆粒狀物質(zhì)多，細胞可長成復(fù)層(圖1a)。原代HUVECs多呈橢圓形或小三角形、短梭形，第3～4天匯合成單層，細胞邊界清楚,胞質(zhì)豐富，胞核呈圓形或橢圓形，偶見雙核，密集處呈鋪路石狀鑲嵌排列，稀疏處為短梭形。傳代培養(yǎng)的細胞形態(tài)飽滿，伸展呈長梭形，漩渦狀排列生長，細胞貼壁牢固；細胞傳至第3代出現(xiàn)管腔樣結(jié)構(gòu)(圖1b)。

2.2透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)透射電鏡下，內(nèi)皮細胞核清晰，細胞質(zhì)內(nèi)微絲、微管結(jié)構(gòu)整齊，在少數(shù)細胞核周的細胞質(zhì)中可見內(nèi)皮細胞所特有的桿狀小體,即Webel-Palade小體,其為質(zhì)膜所包裹,橫切面呈圓形或橢圓形，內(nèi)有微管樣結(jié)構(gòu)。在EA.HY926細胞株里較少見Webel-Palade小體(圖2a)，原代臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)里可發(fā)現(xiàn)較多的橫切與縱切的Webel-Palade小體(圖2b)。

a： EA.HY926細胞株第4天 b：原代HUVECs 第4天 a: EA.HY926細胞株超微結(jié)構(gòu) b: 原代HUVECs超微結(jié)構(gòu)

2.3 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色程度比較細胞質(zhì)染色成棕黃色顆粒的細胞為內(nèi)皮細胞，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定EA.HY926細胞株染色表現(xiàn)為淡黃色(圖3a、3b)，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度值為(2 234.02±78.78)；原代HUVECs細胞質(zhì)表現(xiàn)為棕黃色顆粒(圖3c、3d)，用Image-Pro Plus 6.0軟件分析平均光密度值為(4 138.8±594.01)。原代HUVECs的染色程度明顯較EA.HY926細胞株高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

a：EA.HY926細胞株Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色 b：EA.HY926細胞株Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化蘇木素細胞核染色 c：原代HUVECsⅧ因子相關(guān)抗原免疫組化染色 d：原代HUVECsⅧ因子相關(guān)抗原免疫組化蘇木素細胞核染色

2.4細胞增長情況原代HUVECs 48 h開始進入生長期，96 h達到高峰后，細胞開始衰老，趨向凋亡(圖4a)。EA.HY926細胞株48 h開始進入生長期，96～120 h達到高峰后，進入穩(wěn)定生長，生長幅度較小(圖4b)。

3 討論

臍靜脈內(nèi)皮細胞是血管細胞實驗主要的內(nèi)皮細胞來源，原代HUVECs研究方法在不斷地改進,原代細胞培養(yǎng)的具體方法有組織塊移植法、機械刮取法以及酶消化法[6]，酶消化法配制簡單,細胞貼壁良好，2～3 d即可傳代[5,7]，以其操作簡單、費用低廉遂逐漸替代前2種方法。

EA.HY926人臍靜脈內(nèi)皮細胞株是人臍靜脈內(nèi)皮細胞和人肺腺癌細胞株A549雜交成的永生化細胞株，具有血管內(nèi)皮細胞的特性，已廣泛用于內(nèi)皮細胞相關(guān)研究。本研究對培養(yǎng)EA.HY926細胞株和原代HUVEC進行比較，發(fā)現(xiàn)2種細胞的培養(yǎng)方法和生物特性都有一定的不同，主要表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)2種細胞所用的M199生長液配制成分不同。(2)在細胞的傳代方面，長滿的原代HUVECs(25 cm2)用1 mL的0.02 %EDTA+0.05%胰酶消化液消化效果最佳，在2～3 min時間可以消化95%以上的貼壁細胞;而EA.HY926細胞株用0.25%的胰酶消化液效果最佳，在1～2 min時間可消化95%以上的細胞。(3)透射電子顯微鏡觀察2種細胞超微結(jié)構(gòu)，原代HUVECs中易發(fā)現(xiàn)較多的縱切與橫切Webel-Palade小體，而EA.HY926細胞株上較少見。(4)對Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化染色結(jié)果統(tǒng)計分析后，2種細胞染色程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義，原代細胞染色程度高于EA.HY926細胞株。(5)由細胞增長曲線可明顯看出，原代HUVECs比EA.HY926細胞株脆弱，生長期較短，不能復(fù)層生長；而EA.HY926細胞株性能穩(wěn)定，生長期較長，可復(fù)層生長。

a:原代HUVECs生長曲線 b: EA.HY926細胞株生長曲線

總之，原代HUVECs形態(tài)和生物特性較EA.HY926細胞株完整，但培養(yǎng)耗時長，產(chǎn)量低于EA.HY926細胞株，易出現(xiàn)雜細胞的污染，細胞的增殖能力有限，必須加入生長因子，花費較高，且細胞的活力與表型隨著供者的代數(shù)的不同而不同，造成系統(tǒng)誤差較大。EA.HY926細胞株雖生物特性較原代差，但操作簡便，具有一定程度的原代HUVECs所具有的生物特性，細胞均一以及增長旺盛，適用于較復(fù)雜的、細胞創(chuàng)傷較大的體外內(nèi)皮細胞的研究。

參考文獻:

[1] 蔡維霞，梁亮．人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞體外培養(yǎng)方法的研究[J]．中國修復(fù)重建外科雜志，2011，25(2)：139-147．

[2] Siow RC． Culture of human endothelial cells from umbilical veins[J]．Methods Mol Biol，2012，806: 265-274．

[3] Baudin A，Bruneel A，Bosselut N，et al．A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells[J]．Nature Protocols，2007，2(3)：481-485.

[4] 王皓，張靜生．人臍靜脈內(nèi)皮細胞的體外培養(yǎng)[J]．中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6(3)：368-369．

[5] 張瑛，鄒和群．改良酶消化外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞[J]．山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，43(6)：476-478．

[6] Kadam SS,Tiwari S,Bhonde RR.Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymalstem cells from the human umbilical cord[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2009,45(1-2) :23-27.

[7] 白燕慧，張明昌．胰蛋白酶消化法體外培養(yǎng)和鑒定人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞[J]．中國組織工程研究，2012，16(15)：2695-2698．