馬麗媛，李曉東c，莊建鵬，尚爾坤，任紅晶，李明浩，劉璐，畢偉偉

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué) a.乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.食品學(xué)院，c.食品安全與營養(yǎng)協(xié)同創(chuàng)新中心；哈爾濱 150030)

0 引 言

干酪副產(chǎn)物乳清營養(yǎng)價(jià)值獨(dú)特，其主要成分乳清蛋白已被證實(shí)含有很多潛在的生物活性肽段，這些生物活性肽在原乳清蛋白序列中并無活性，一般通過胃腸道時(shí)釋放出來的很少，但在體外可通過酶解及分離純化技術(shù)將其釋放出來，包括具有抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗氧化等功能的活性肽[1,2]。Nagaoka,S通過小鼠生物實(shí)驗(yàn)證明，相比大豆蛋白和酪蛋白，牛乳清蛋白源生物活性肽具有更強(qiáng)的降低血液膽固醇的活性[3]。

凝膠過濾色譜是很好的分離純化肽的方法，它是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩，將不同分子大小的物質(zhì)分離開來，是一種液體柱層析技術(shù)[4,5]。凝膠過濾色譜不僅能將肽分離純化，還可以分析肽的相對(duì)分子質(zhì)量，其分離分析簡(jiǎn)單快速而被廣泛應(yīng)用。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料

乳清蛋白產(chǎn)品；蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(胰蛋白酶、溶菌酶、糜蛋白酶、牛胰島素、維生素B12)；凝膠葡聚糖Sephadex G-50。

1.2 設(shè)備

WIGGENS數(shù)字式攪拌器，SMB-20型超濾設(shè)備，TDL-500B冷凍離心機(jī)，LGJ-1型冷凍干燥機(jī)，KQ-500B型超聲波清洗器，玻璃層析柱1.5 cm×70 cm，?KTATMprime蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白水解肽的制備

取一定量的乳清蛋白配制成一定濃度的水溶液，置于恒溫水浴鍋中90℃高溫滅酶活10 min后，冷卻至酶解溫度，用濃度為1.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酶解液pH值至適宜條件，加入一定量的胰蛋白酶，將數(shù)字?jǐn)嚢杵鞑迦肴芤褐羞x擇一定轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌，水解過程中不斷加入適量氫氧化鈉溶液以維持pH值在適宜范圍內(nèi)，水解結(jié)束時(shí)將水溫再次調(diào)至90℃高溫滅酶活10 min，4 000 g離心10 min，排除沉淀，上層清液使用10 ku截留薄膜超濾，收集超濾透過液，即為乳清蛋白水解液。冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 凝膠色譜分離降膽固醇活性肽

1.3.2.1 凝膠前處理

將一定量凝膠葡聚糖Sephadex G-50溶于水后經(jīng)沸水溶脹2 h，冷卻至室溫，真空抽濾去除氣體后裝柱。將1.5 cm×70 cm的玻璃層析柱垂直固定在蛋白純化儀的支架上，將預(yù)處理好的Sephadex G-50緩慢裝入層析柱中，先加入緩沖液，緩沖液體積占柱體積10%～15%為宜，后緩慢加入膠液，保證凝膠液面水平，打開出液口排出多余緩沖液，使柱內(nèi)膠面上部保留2～3 cm緩沖液為宜。再將玻璃層析柱上兩端的的進(jìn)出液管口分別與儀器上相應(yīng)的進(jìn)出液位置相連，打開機(jī)器，用3～5倍柱體積緩沖液沖洗機(jī)器和柱子，待機(jī)器紫外檢測(cè)值穩(wěn)定后上樣。

1.3.2.2 繪制凝膠過濾色譜的分子量校正曲線

選擇幾種已知分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，由于凝膠葡聚糖Sephadex G-50分離的范圍是1 500～30 000 u，所以實(shí)驗(yàn)選擇胰蛋白酶(MW 23.3 ku)、溶菌酶(MW 14.4 ku)、 糜蛋白酶 (MW 11.0 ku)、 牛胰島素(MW 5.73 ku)、維生素B12(MW 1.36 ku)，質(zhì)量濃度為1.0 g/L，一次進(jìn)樣6 mL(凝膠總體積的5%)，將標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行凝膠層析，記錄每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)出現(xiàn)峰值的時(shí)間，以蛋白標(biāo)品分子量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，出現(xiàn)峰值的洗脫時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制校正曲線。

1.3.2.3 凝膠過濾色譜純化乳清蛋白肽條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別選擇磷酸鈉緩沖液、醋酸鈉緩沖液和Tris-HCl緩沖液3種溶液作為流動(dòng)相，在其他條件一定的情況下對(duì)乳清蛋白肽進(jìn)行分離純化，根據(jù)凝膠分離效果篩選合適的洗脫溶液，分別進(jìn)行洗脫，并對(duì)篩選的洗脫液濃度和pH值進(jìn)行優(yōu)化，收集每個(gè)洗脫峰的組分，測(cè)定其降膽固醇活性。

取凍干后的水解肽，用一定濃度的緩沖液配制成質(zhì)量濃度為20 g/L的溶液，通過進(jìn)樣環(huán)進(jìn)樣。調(diào)節(jié)壓力為1.0 MPa，流速為1 mL/min，樣品收集為2 mL/管，一次上樣6 mL(5%BV)，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)為280 nm，收集各個(gè)洗脫峰，經(jīng)冷凍干燥后備用。

1.3.3 降膽固醇活性的測(cè)定

Nagaoka S.等人研究發(fā)現(xiàn)，通過配制一種模擬人體胃腸道環(huán)境的人造膽汁膠束溶液，經(jīng)超速冷凍離心使膠束溶液發(fā)生兩相分離，然后測(cè)定其水相中膽固醇溶出的含量，來考察乳清蛋白肽對(duì)膽固醇在膠束溶液中的溶解度的影響，進(jìn)而成為衡量降膽固醇活性高低的指標(biāo)。

參照Charles F.Shoemaker[6]等人的方法并略作修改，配制模擬膽汁膠束溶液包含：濃度為0.01 mol/L?；悄懰徕c，0.002 mol/L膽固醇，0.005 mol/L油酸，0.135 mol/L氯化鈉，0.015 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH值為7.4)，質(zhì)量濃度為5 g/L水解肽粉末，通過超聲波乳化制得，然后37℃培養(yǎng)24 h，100 000 g離心60 min后取上清液測(cè)定膽固醇濃度。上清液中的膽固醇濃度即為膽固醇膠束溶解度，以不加水解肽的膠束溶液為空白，按下式計(jì)算水解肽對(duì)膽固醇在模擬膽汁膠束溶液中的溶解度的抑制率為

抑制率=(M-N)/M×100%

式中：M為空白對(duì)照溶液的膽固醇溶解度(mol/L)；N為樣品溶液的膽固醇溶解度(mol/L)。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子量校正曲線的繪制

將已知分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行凝膠層析，研究蛋白質(zhì)分子量對(duì)數(shù)與其出峰時(shí)間的關(guān)系，如圖1所示。

圖1 蛋白標(biāo)品分子量對(duì)數(shù)與出峰時(shí)間的關(guān)系

由圖1可以看出，蛋白標(biāo)品分子量的對(duì)數(shù)和出峰時(shí)間之間存在明顯的線性關(guān)系，得到回歸方程：y=-0.014x+4.5203(R2=0.9785)，根據(jù)這個(gè)回歸方程可以粗略計(jì)算樣品中多肽的分子量分布。

2.2 凝膠過濾色譜純化乳清降膽固醇肽分離條件的篩選

為得到好的分離效果，在流速1 mL/min、壓力1.0 MPa、凝膠體積120 mL等其他條件一致的情況下，比較了相同濃度和pH值的3種洗脫流動(dòng)相對(duì)乳清蛋白降膽固醇肽的分離情況，同時(shí)對(duì)篩選的洗脫液濃度和pH值進(jìn)行優(yōu)化。

2.2.1 洗脫流動(dòng)相種類篩選

圖2為pH 值為7.0，濃度為0.05 mol/L洗脫流動(dòng)相種類篩選結(jié)果。由圖2可以看出，以Tris-HCl和醋酸鈉溶液作為流動(dòng)相洗脫時(shí)，只出現(xiàn)了兩個(gè)明顯的洗脫峰，而相同條件的磷酸鈉溶液作為流動(dòng)相時(shí)洗脫得到了3個(gè)明顯的洗脫峰，分離效果較好。所以選擇磷酸鈉溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

圖2 相同pH值和濃度下各洗脫流動(dòng)相種類篩選結(jié)果

2.2.2 pH值篩選

在其他條件一致的情況下，考察了不同pH值的磷酸鈉緩沖液對(duì)乳清蛋白降膽固醇肽的分離情況，結(jié)果如圖3所示。

圖3 相同濃度不同pH值下洗脫液pH值篩選結(jié)果

由圖3可以看出，當(dāng)pH值為6.0時(shí)，洗脫的第2個(gè)峰與第1個(gè)峰沒有完全分開，兩峰有粘連現(xiàn)象；當(dāng)pH值為7.0時(shí)，雖然前兩個(gè)峰明顯分開，但是第3個(gè)峰峰型不完整，沒有很好的洗脫出來；當(dāng)pH值為8.0時(shí)，可以明顯的看到三個(gè)界限較清晰地組分峰，此pH值下的分離效果較好。

2.2.3 洗脫液濃度篩選

在其他條件一致的情況下，選擇pH值為8.0的不同濃度的磷酸鈉緩沖液對(duì)乳清蛋白降膽固醇肽進(jìn)行分離，篩選最佳流動(dòng)相濃度，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著洗脫流動(dòng)相的濃度增大，分離效果呈現(xiàn)越來越差的現(xiàn)象。可能是由于離子強(qiáng)度過大，待分離肽與凝膠之間結(jié)合力較小，峰與峰之間出現(xiàn)粘連、甚至拖尾現(xiàn)象。而當(dāng)磷酸鹽洗脫液的濃度為0.03 mol/L時(shí)，待分離肽被分成3個(gè)明顯的組分峰，且峰型較窄，無拖尾現(xiàn)象，顯示分離效果較好。

綜上所述，當(dāng)選擇pH值為8.0，濃度為0.03 mol/L的磷酸鈉溶液作為洗脫流動(dòng)相，在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下測(cè)定各個(gè)管中的吸光值，組分的凝膠層析圖共出現(xiàn)3個(gè)比較明顯的峰，3個(gè)洗脫組分峰得到了較好的分離，與其他分離條件相比較分離效果較好。所以本實(shí)驗(yàn)選擇pH值為8.0，濃度為0.03 mol/L的磷酸鈉溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將洗脫下來的3個(gè)峰的液體收集，重復(fù)多次上樣，真空濃縮，冷凍干燥，分別測(cè)定它們的降膽固醇活性。

2.3 目標(biāo)活性肽的降膽固醇活性及分子量分布

水解肽經(jīng)凝膠葡聚糖Sephadex G-50分離得到的3個(gè)組分峰(圖4a)分別命名為：F1，F(xiàn)2，F(xiàn)3，經(jīng)真空濃縮，冷凍干燥，測(cè)定的膽固醇膠束溶解度抑制率結(jié)果如表1所示。

圖4 不同濃度下的洗脫液液濃度的篩選結(jié)果

由表1可以看出，經(jīng)Sephadex G-50凝膠層析分離前后水解肽的膽固醇膠束溶解度抑制率差異顯著，且第1、2、3洗脫組分的降膽固醇活性差異顯著，洗脫組分F2的膽固醇膠束溶解度抑制率最高為57.48%，可以確定F2組分即為目標(biāo)活性肽，即降膽固醇肽。根據(jù)凝膠分子量校正曲線計(jì)算可知降膽固醇肽的分子量在2 000～4 700 u范圍內(nèi)。

表1 3個(gè)組分的膽固醇膠束溶解度抑制率和分子量分布

3 結(jié) 論

本文研究了凝膠過濾色譜分離純化乳清蛋白降膽固醇肽的洗脫條件，確定的最佳洗脫流動(dòng)相為pH值為8.0，濃度為0.03 mol/L的磷酸鈉溶液。在此條件下，乳清蛋白降膽固醇肽經(jīng)凝膠葡聚糖Sephadex G-50分離純化后，膽固醇膠束溶解度抑制活性從24.18%提高到至57.48%，分子量分布在2 000～4 700 u范圍內(nèi)。研究結(jié)果表明，采用凝膠過濾色譜法純化乳清蛋白降膽固醇肽是完全可行的，在提高活性肽生物活性的同時(shí)，還可以對(duì)活性肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行分析。但是經(jīng)凝膠過濾色譜純化后的乳清蛋白降膽固醇肽還不是單一組分，在下一步的工作中，將運(yùn)用反相高效液相色譜對(duì)其進(jìn)一步純化。

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