許安萍，唐銀杉，陳萬順，莫雨平，姚海江，賽因朝克圖，李志剛

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶減退為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。分子遺傳學(xué)研究顯示，AD 的發(fā)生及其病理變化過程與β 淀粉樣前體蛋白(amyloid precuesor protein，APP)、載脂蛋白E(apolipoprotien E，ApoE)等基因的異常表達(dá)密切相關(guān)。APP 經(jīng)分泌酶水解產(chǎn)生β 淀粉樣蛋白(amyloid β，Aβ)，是AD 患者腦內(nèi)特征性病理產(chǎn)物老年斑的主要成分［1］。而ApoE 既能促進(jìn)腦組織中Aβ 的聚集，又能促進(jìn)tau 蛋白過度磷酸化，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，被認(rèn)為是與AD 相關(guān)的主要風(fēng)險基因［2］。多項研究已表明［3-5］，電針治療AD 有較好療效。但不同電針對AD 的治療作用途徑及療效是否有差異未見報道。本實驗通過觀察脈沖電針和音樂電針對SAPM8 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及大腦皮層APP 、ApoE mRNA 表達(dá)的影響，探討電針治療AD 的可能作用機(jī)制，并比較兩種電針的療效差異，為不同電針治療AD提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

雄性快速老化小鼠亞系(Senescence accelerated mouse/prone8，SAMP8)小鼠，8 月齡，體質(zhì)重(30 ±2)g，清潔級，共24 只。同背景、同月齡抗快速老化小鼠亞系(Senescence accelerated mouse/resistancel，SAMR1)小鼠8 只。購于天津中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，合格證號:SCXK(津)2008-001。實驗動物單籠飼養(yǎng)，實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。動物飼養(yǎng)環(huán)境:溫度(23 ±1)℃，濕度45%。

1.2 試劑與藥物

Trizol 試劑盒(美國Invitrogen 公司)，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Oligd(T)、dNTP 、DNA Marker(日本Takara 公司)，SYBR mix(美國ABI 公司)，Real-time PCR 擴(kuò)增試劑盒(中國北京中原領(lǐng)先科技有限公司)，PCR 引物(生工生物工程有限公司)。

1.3 儀器

韓氏穴位神經(jīng)刺激儀HANS-202 型(南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司)，音樂電針治療儀ZJ-12H 型(深圳市圣祥高科技有限公司)，Morris 水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)，實時熒光定量PCR 儀ABI 7500(美國ABI)，臺式高速常溫離心機(jī)5417C(德國eppendorf)，微量加樣器Reference(德國eppendorf)，紫外分光光度儀Biophotometer(德國eppendorf )，恒溫金屬浴HB-202 (中國北京中西遠(yuǎn)大公司)，凝膠成像系統(tǒng)Gel Doc 2000(美國Bio-rad)。

2 方法

2.1 分組

SAMP8 小鼠隨機(jī)分為模型組、脈沖電針組、音樂電針組，每組8 只，SAMR1 小鼠8 只，作為正常組。脈沖電針組:接受脈沖電針干預(yù)。音樂電針組:接受音樂電針干預(yù)。正常組、模型組接受與電針組相同方法的束縛。以上4 組同步進(jìn)行實驗，每天1 次，連續(xù)15 天。

2.2 針刺方法

取穴:參考《實驗針灸學(xué)》［6］，選取百會穴、印堂穴及水溝穴。

針刺操作:以自制鼠套將小鼠束縛，用30 號1 寸毫針平刺進(jìn)針，百會穴針尖向后頭部、印堂穴針尖向鼻尖方向，進(jìn)針深度為3 ～5 mm。脈沖電針組連接韓氏電針儀，疏波，電針頻率為2 Hz，電壓為2 V，電流強(qiáng)度為1 mA。音樂電針組連接音樂電針治療儀，音樂選取健腦益智類，電流強(qiáng)度為1 mA，強(qiáng)度調(diào)節(jié)以動物保持安靜不掙扎嘶叫為度。兩組均留針20 min，起針后點刺水溝穴。

2.3 行為學(xué)檢測

治療結(jié)束后，用Morris 水迷宮法測定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力［7］。①隱蔽平臺試驗:通過訓(xùn)練小鼠游泳尋找平臺，檢測其學(xué)習(xí)能力。訓(xùn)練時先將動物置于平臺上10 s，然后將小鼠在除平臺所在象限外的其他3 個象限各選距水池中心相等的點作為入水點，分別將小鼠放入水中，記錄其從入水至找到平臺的時間(逃避潛伏期)。如果60 s 內(nèi)找不到平臺，潛伏期記為60 s。每天各訓(xùn)練2 次，歷時5 天。②空間探索試驗:第6天，撤除平臺，分別在3 個象限的入水點放入小鼠，記錄小鼠60 s 內(nèi)在目標(biāo)象限(原平臺象限)停留時間。

2.4 檢測小鼠大腦皮層中APP、ApoE mRNA 的表達(dá)

采用實時熒光定量PCR 法檢測。小鼠快速斷頭處死后迅速取出腦組織，于無菌工作臺冰盤上分離出大腦皮層，放入無菌凍存管置于液氮中，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存待測。①樣本RNA 提取:將小鼠大腦皮層組織標(biāo)本按Trizol 提取試劑盒說明操作提取RNA。②RNA 質(zhì)量檢測:用核酸紫外分光光度計測定經(jīng)稀釋的RNA 提取物的OD 值和濃度，判斷其純度。③樣本cDNA 合成:按說明操作，用20 μL 反應(yīng)體系，以O(shè)ligo(dT)1 μL 為引物，將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存。④PCR 擴(kuò)增:取2 μL cDNA 稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品，用20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性15 min，94℃15 s，60℃34 s，72℃15 s，共40 個循環(huán)擴(kuò)增，最后72℃10 min 延伸。⑤引物序列:GAPDHF 上游引物5'- GGGTGTGAACCATGAGAAGT-3'，下游引物5'- GACTGTGGTCATGAGTCCT-3'，片段長度136 bp。APP 上游引物5'- ACATGATCAGTGAGCCCAGA- 3'，下 游 引 物 5'- TCAACAGGCTCGACTTCATT-3'，片段長度187 bp。ApoE 上游引物5'-AGCCGACATGGAGGATCTAC-3'，下游引物5'- TGCCTTGTACACAGCTAGGC-3'，片段長度178 bp。⑥樣本PCR 反應(yīng):應(yīng)用ABI 7500 Real-Time PCR儀進(jìn)行檢測，測得目的基因的CT值。用比較CT值法分析結(jié)果［8］，ΔΔCT=(CT目的基因- CT內(nèi)參基因)處理組-(CT目的基因- CT內(nèi)參基因)正常組。

2.5 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS19.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。組間差異比較，數(shù)據(jù)正態(tài)分布、方差齊時采用單因素方差分析LSD 檢驗，數(shù)據(jù)非正態(tài)分布和/或方差不齊時采用單因素方差分析Dunnett’sT3 檢驗，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，以P ＜0.05 為有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 不同電針對SAMP8 小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

3.1.1 隱蔽平臺試驗結(jié)果 如表1 所示，與正常組比較，模型組逃避潛伏期時間顯著增加(P ＜0.05)，說明8 月齡SAMP8 小鼠已出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶衰退;與模型組比較，訓(xùn)練第4 天時音樂電針組逃避潛伏期明顯下降(P ＜0. 05)，第5 天時脈沖電針組明顯下降(P ＜0.05)。

表1 各組小鼠Morris 水迷宮實驗逃避潛伏期比較(±s，單位:s)

表1 各組小鼠Morris 水迷宮實驗逃避潛伏期比較(±s，單位:s)

注:與正常組比較，#P ＜0.05;與模型組比較，* P ＜0.05。

組別 例數(shù) 第1 天 第2 天 第3 天 第4 天 第5天正常組 8 51.54 ±4.84 47.16 ±9.00 38.52 ±4.35 36.23 ±6.27 37.61 ±4.80模型組 8 58.00 ±3.66# 54.26 ±7.37# 54.21 ±8.24# 52.77 ±7.69# 53.74 ±5.98#脈沖電針組 8 57.56 ±4.31# 53.58 ±8.18# 52.20 ±8.39# 51.14 ±3.95# 44.99 ±7.69*音樂電針組 8 55.90 ±5.57# 51.84 ±4.25# 47.42 ±6.87# 44.03 ±6.28* 40.41 ±6.38*

3.1.2 空間探索試驗結(jié)果 如表2 所示，第6 天撤除水下平臺后，比較各組在目標(biāo)象限游泳時間。模型組較正常組在目標(biāo)象限游泳時間明顯減少(P ＜0.05);兩電針組較模型組在目標(biāo)象限游泳時間明顯延長(P ＜0.05)，兩電針組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P ＞0.05)。

表2 各組小鼠Morris 水迷宮實驗?zāi)繕?biāo)象限游泳時間比較(±s，單位:s)

表2 各組小鼠Morris 水迷宮實驗?zāi)繕?biāo)象限游泳時間比較(±s，單位:s)

注:與正常組比較，#P ＜0.05;與模型組比較，* P ＜0.05。

組別 例數(shù) 目標(biāo)象限游泳時間正常組823.67 ±5.78模型組 8 12.09 ±6.97#脈沖電針組 8 29.18 ±10.68*音樂電針組 8 26.50 ±4.93*

3.2 不同電針對SAMP8 小鼠大腦皮層APP、ApoE mRNA 表達(dá)的影響

如表3 所示，與正常組比較，模型組小鼠大腦皮層APP mRNA、ApoE mRNA 表達(dá)水平均明顯提高(P ＜0.05);與模型組比較，脈沖電針組、音樂電針組APPmRNA 表達(dá)水平明顯下調(diào)(P ＜0.05)，ApoE mRNA表達(dá)水平有下調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異。

表3 各組小鼠APP、ApoEmRNA 表達(dá)比較(±s)

表3 各組小鼠APP、ApoEmRNA 表達(dá)比較(±s)

注:與正常組比較，#P ＜0.05;與模型組比較，* P ＜0.05。

組別 例數(shù)APP mRNA ApoE mRNA正常組8 1.02 ±0.24 1.01 ±0.14模型組 8 4.97 ±0.79 # 3.89 ±0.32#脈沖電針組 8 2.25 ±0.52* 3.03 ±0.50音樂電針組 8 2.38 ±0.50*2.56 ±0.63

4 討論

大量家族史及雙胞胎的研究均表明遺傳因素在AD 的發(fā)病中具有極其重要的作用。APP 基因是第1個被發(fā)現(xiàn)與AD 有關(guān)的基因，國外早期采用原位分子雜交法證明其在AD 的腦組織中存在過度表達(dá)。另外，由該基因16、17 外顯子編碼的蛋白質(zhì)異構(gòu)體APP經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶水解產(chǎn)生的Aβ 可誘發(fā)神經(jīng)元變性［9］。研究顯示，APP 可能具有受體功能，如果APP 過高表達(dá)或APP 突變體表達(dá)均可引起細(xì)胞內(nèi)α-APP 和β-APP 等片段水平升高，它們可擾亂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，引發(fā)細(xì)胞凋亡［10］。ApoE 基因主要與晚發(fā)型AD相關(guān)。動物實驗表明，ApoE 大量存在于AD 模型小鼠腦內(nèi)的老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)中，并且能夠使腦組織中過度磷酸化的tau 蛋白含量增加［11］。ApoE 影響APP 的β 折疊，促進(jìn)Aβ 構(gòu)型改變，使可溶性Aβ 變成具有神經(jīng)毒性的不可容性的Aβ 多聚物。因此，下調(diào)APP、ApoE mRNA，抑制APP 及ApoE 在腦內(nèi)過度表達(dá)，可一定程度改善AD。

本實驗結(jié)果顯示，脈沖電針和音樂電針均可改善AD 模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，但音樂電針對改善學(xué)習(xí)記憶的獲取能力優(yōu)于脈沖電針，而對于維持空間位置記憶兩者相當(dāng);在調(diào)控基因表達(dá)方面，兩種電針均可下調(diào)APP mRNA 表達(dá)，音樂電針不亞于脈沖電針，但對ApoE mRNA 無顯著作用，原因可能是ApoE 基因具有多態(tài)性，有ApoE2、ApoE3、ApoE4 3 個不同等位基因，因此還不能否認(rèn)電針對ApoE mRNA 表達(dá)無調(diào)控作用，有待于對不同基因型進(jìn)一步研究。電針抗癡呆作用途徑復(fù)雜多樣，通過抑制APP mRNA 表達(dá)，減少APP 水解產(chǎn)生Aβ 可能是電針抗癡呆的作用途徑之一。音樂電針作用與脈沖電針相比略勝一籌，但無顯著性差異，考慮將模型動物換成靈長類等智力較高的動物，可能作用更加顯著。

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