吳勇 葉芬 葛軼睿 陸燕 魏銳利

視網(wǎng)膜缺血再灌注損傷(retinal ischemical reperfusion injury,RIRI)在眼科臨床上非常多見，是許多疾病都要經(jīng)歷的生理及病理過(guò)程，一些眼科常見病如視網(wǎng)膜中央動(dòng)靜脈阻塞、急性閉角型青光眼、糖尿病以及玻璃體視網(wǎng)膜病變等都會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的視網(wǎng)膜缺血[1]，RIRI后視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，但不是視網(wǎng)膜視功能得以恢復(fù)，而是出現(xiàn)更加嚴(yán)重的損害[2]，如何減輕RIRI導(dǎo)致的視網(wǎng)膜功能損害是臨床急需解決的問(wèn)題。本研究通過(guò)建立大鼠RIRI模型，觀察分析核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)活性抑制劑SN50對(duì)視網(wǎng)膜功能的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年SD雄性大鼠27只，體質(zhì)量(220±20)g，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)的普通級(jí)環(huán)境中，所有動(dòng)物經(jīng)一般體格檢查和眼部檢查均無(wú)明顯異常，隨機(jī)分為正常對(duì)照組9只、RIRI組9只、RIRI+ SN50組9只。

1.2主要儀器設(shè)備及用品大鼠腦立體定位儀(Biomy公司)，ECLIPSE 80i正置顯微鏡(Nikon公司)，Rotor-Gene 6000熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀(QIAGEN公司)，石蠟切片機(jī)(Leica公司)，手術(shù)器械、眼科手術(shù)顯微鏡(上海金鐘公司)，NF-κB p50抗體(Senta Cruz公司)，GAPDH抗體(Senta Cruz公司)，SN50(Biomy公司)，TNF-α Rat ELISA Kit(Invitrogen公司)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天公司)。

1.3大鼠RIRI模型的建立首先用戊巴比妥鈉注射液按35 mg·kg-1劑量予以大鼠腹腔注射麻醉，用立體儀固定動(dòng)物，眼瞼拉鉤將下瞼向下拉，慢慢地將眼球暴露出來(lái)，將注滿乳酸林格液的4.5號(hào)頭皮針從顳側(cè)角膜緣刺入，直至前房進(jìn)行灌注，不要碰到虹膜及晶狀體；血壓計(jì)氣囊的輸出管接有三通管，分別是血壓計(jì)、水銀壓力表、輸液器，輸液器注滿林格液，將大鼠眼壓調(diào)整并維持血壓計(jì)壓力刻度在15 kPa，此時(shí)可以看到球結(jié)膜及虹膜的顏色變蒼白，眼底視網(wǎng)膜的顏色也變蒼白，保持前房灌注加壓，使得視網(wǎng)膜持續(xù)缺血60 min，之后逐漸將灌注壓降至正常，穿刺針頭拔出?？梢钥吹角蚪Y(jié)膜、虹膜的顏色恢復(fù)成原來(lái)的顏色，眼底視網(wǎng)膜的顏色也恢復(fù)至正常的橘紅色，這表明所有受阻的血流已重新再通，形成了再灌注。正常對(duì)照組大鼠除不升高眼壓外，其余操作步驟同RIRI組，RIRI+ SN50組的大鼠在RIRI的基礎(chǔ)上眼部玻璃體注射1 μL SN50(50 μmol·L-1)。

1.4標(biāo)本取材及HE染色RIRI后6 h、24 h、72 h采用戊巴比妥分別處死大鼠3只，摘除眼球，保留 1～2 mm視神經(jīng)，標(biāo)本視神經(jīng)處縫線做標(biāo)記。設(shè)置溫度為4 ℃，并在40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h。按照不同的酒精濃度進(jìn)行脫水，二甲苯透明，切片石蠟包埋，厚度4 mm，放置在干凈的玻片上，再放在60 ℃烤箱后續(xù)使用。按照脫蠟、水化、蘇木精液染色、體積分?jǐn)?shù)1%鹽酸乙醇分化、水洗、體積分?jǐn)?shù)0.5%伊紅液染色、水洗、脫水、透明、中性樹膠封固、拍照等步驟進(jìn)行操作。

1.5免疫組織化學(xué)檢測(cè)NF-κB的表達(dá)部位組織切片脫蠟以及水化，在不同濃度的酒精中放置以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS洗2次，每次5 min；抗原的修復(fù)采用0.01 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖溶液(pH6.0)放入微波爐加熱至沸騰，再把福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片置入，每隔5 min 1次，共2次；最后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，清洗、加入抗原及試劑、脫洗、DAB顯色、封片、備用鏡檢。

1.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TNF-α的表達(dá)根據(jù)文獻(xiàn)提供合成引物的序列：TNF-α，上游：5’-CATCCGTTCTCTACCCAGCC-3’，下游：5’-AATTCTGAGCCCGGAGTTGG-3’；Actin，上游：5’- CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3’，下游：5’- ATACCCACCATCACACCCTG-3’。提取總RNA：液氮冷卻條件下研磨組織，經(jīng)過(guò)試劑添加、離心、去清、靜置等步驟，最后用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各樣品的OD260/OD280值來(lái)計(jì)算RNA濃度，再用10 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳來(lái)確定mRNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄PCR：在42 ℃條件下逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)1 h。在75 ℃條件下滅活A(yù)MV 10 min。實(shí)時(shí)定量PCR：根據(jù)相應(yīng)的反應(yīng)體系及反應(yīng)程序，并以Actin作為內(nèi)參照，計(jì)算產(chǎn)物的相對(duì)量。應(yīng)用相對(duì)定量2-△△Ct法公式來(lái)計(jì)算結(jié)果。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，成組的多個(gè)樣本均數(shù)采用one way ANOVA方差分析進(jìn)行比較，兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠視網(wǎng)膜病理變化正常對(duì)照組視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)顯示清晰，未見明顯異常。RIRI組在RIRI 6 h后，視網(wǎng)膜整個(gè)結(jié)構(gòu)輕度水腫，少量細(xì)胞變性；RIRI 24 h后，視網(wǎng)膜各層呈現(xiàn)高度水腫，細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)叢狀層、神經(jīng)纖維層尤為明顯，大部分神經(jīng)節(jié)細(xì)胞出現(xiàn)變性；RIRI 72 h后，整個(gè)視網(wǎng)膜損傷更加明顯，除了全層明顯水腫外，各層細(xì)胞排列紊亂、結(jié)構(gòu)破壞，并伴有炎性細(xì)胞的聚集。RIRI+ SN50組SN50注射6 h及24 h后可以觀察到視網(wǎng)膜全層結(jié)構(gòu)基本清晰，輕度水腫，未見明顯的細(xì)胞變性；72 h后視網(wǎng)膜水腫有所加重，細(xì)胞排列紊亂，少量細(xì)胞變性(圖1)。

2.2大鼠視網(wǎng)膜NF-κB的表達(dá)RIRI組在RIRI 6 h后神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層陽(yáng)性表達(dá)NF-κB，24 h后NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)叢狀層細(xì)胞尤為明顯，72 h之后視網(wǎng)膜近全層都可以看到NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)。RIRI+ SN50組SN50注射6 h后NF-κB的陽(yáng)性表達(dá)不明顯，24 h后NF-κB在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有所表達(dá)，72 h后NF-κB陽(yáng)性表達(dá)有所增強(qiáng)(圖2)。

2.3大鼠視網(wǎng)膜TNF-α的表達(dá)RIRI組及RIRI+ SN50組RIRI 6 h后TNF-α的表達(dá)明顯上升，與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)；RIRI組與RIRI+SN50組比較，24 h后視網(wǎng)膜的TNF-α表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖3)。

3 討論

視網(wǎng)膜的血供主要包括視網(wǎng)膜血管以及睫狀血管，但除了該兩套血管系統(tǒng)對(duì)視網(wǎng)膜血供進(jìn)行調(diào)控外，灌注壓、血壓以及眼壓也能夠?qū)σ暰W(wǎng)膜的血供進(jìn)行調(diào)控[3]，通常在眼壓發(fā)生變化或是上升時(shí)，也就是當(dāng)眼壓與視網(wǎng)膜血管的血壓相等時(shí)，如果維持一段時(shí)間，視網(wǎng)膜的各層組織就會(huì)出現(xiàn)缺血或是缺氧的表現(xiàn)，而當(dāng)血液再次流通后，視網(wǎng)膜的視功能傷害更加明顯甚至加重，在這種情況下視網(wǎng)膜就會(huì)發(fā)生RIRI[4]。本研究所采用的是前房灌注加壓法制作RIRI大鼠模型，通過(guò)不同的時(shí)間段來(lái)觀察大鼠RIRI導(dǎo)致視細(xì)胞損害的嚴(yán)重情況。

Figure 1 Pathological changes in retina after SN50 treatment SN50處理后視網(wǎng)膜的病理變化

Figure 2 Expression of NF-κB in retina NF-κB在視網(wǎng)膜的表達(dá)情況

本研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜缺血后再次灌注的過(guò)程中，視網(wǎng)膜的病理?yè)p害隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而日趨嚴(yán)重。臨床上閉角型青光眼患者急性發(fā)作后視網(wǎng)膜的視功能會(huì)明顯受損，也與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，所以說(shuō)針對(duì)青光眼的高眼壓要及時(shí)進(jìn)行降壓處理，這樣對(duì)于減輕視網(wǎng)膜的損傷會(huì)有所幫助。臨床上發(fā)生其他缺血再灌注損傷如視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞時(shí)，也要求盡快改善視網(wǎng)膜的缺血狀態(tài)，盡量在最短的時(shí)間內(nèi)恢復(fù)血液的通暢，在出現(xiàn)缺血再灌注損傷之前控制病情，因此視網(wǎng)膜的損傷與缺血再灌注損傷有著十分密切的關(guān)系。NF-κB是具有多種作用的轉(zhuǎn)錄因子，一般情況下它是以非活性的狀態(tài)存在于細(xì)胞漿中，參與許多基因的表達(dá)與調(diào)控，與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、細(xì)胞轉(zhuǎn)歸等一些病理生理過(guò)程有著十分密切的關(guān)系[5]；TNF-α也是具有多種生物學(xué)功能的細(xì)胞因子，能參與機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)，有實(shí)驗(yàn)觀察到TNF-α在腦組織缺血再灌注后表達(dá)迅速增加[6]。本研究觀察到在缺血再灌注條件下視網(wǎng)膜的NF-κB表達(dá)上調(diào)，TNF-α表達(dá)上調(diào)，大鼠視網(wǎng)膜的組織細(xì)胞病理性改變明顯加重，說(shuō)明NF-κB及TNF-α參與了RIRI。TNF-α可由NF-κB激活，同時(shí)TNF-α又能激活NF-κB形成協(xié)同作用[7]，產(chǎn)生細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)效應(yīng)[8]，擴(kuò)大損傷及反應(yīng)的程度。

Figure 3 Expression of TNF-α in rat retina after SN50 treatment(*P<0.05，**P<0.01) SN50處理后大鼠視網(wǎng)膜TNF-α的表達(dá)情況(*P<0.05、**P<0.01)

目前針對(duì)RIRI治療的方法和藥物比較多[9-11]，包括抗氧化劑、興奮性氨基酸拮抗劑、鈣離子阻滯劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、凋亡抑制劑、糖皮質(zhì)激素及中藥等，但這些藥物均存在給藥途徑和藥物到達(dá)靶點(diǎn)發(fā)揮作用等問(wèn)題需要解決。SN50 是一種NF-κB活性抑制肽，具有很強(qiáng)的細(xì)胞膜穿透能力[12]，能特異性地阻止NF-κB從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，從而抑制了NF-κB的DNA結(jié)合活性。本研究使用SN50干預(yù)RIRI模型大鼠，可以從形態(tài)上觀察到視網(wǎng)膜的損傷得到很好地控制，未見明顯的細(xì)胞變性及壞死。在基因調(diào)控方面，觀察到24 h后視網(wǎng)膜的TNF-α表達(dá)與未給藥相比已有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。SN50可以高效地阻斷NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]，切斷TNF-α-NF-κB—TNF-α的惡性循環(huán)，抑制視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡或死亡。SN50 作為特異性抑制NF-κB 核位移的多肽，作用相當(dāng)強(qiáng)大，因此具有很好的應(yīng)用前景。

RIRI發(fā)生在眼科臨床的多種疾病中，為此有必要加緊研究探索RIRI的發(fā)生機(jī)制、發(fā)展過(guò)程以及最終轉(zhuǎn)歸，為臨床治療各種RIRI疾病提供有力的理論依據(jù)和更有效的治療方法。

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