孫 燕 呂躍軍 華木星 龍海瓊 包賽朵

( 大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 大理 671003)

臭靈丹草Laggera pterodonta(DC.)Benth.為菊科六棱菊屬翼齒六棱菊，別名獅子草、臭葉子、六棱菊等，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南及西南部［1］。主要化學(xué)成分為桉烷型倍半萜和黃酮類化合物，具有抗菌消炎、清熱解毒及抗腫瘤等作用［2］。臭靈丹在云南大理白族自治州各地均有分布。主要用于治療上呼吸道感染、扁桃體炎、咽喉炎、口腔炎、支氣管炎、癰腫疥瘡、燒燙傷、毒蛇咬傷、跌打損傷［3］。對(duì)臭靈丹乙醇提取物抑菌作用的研究尚未見相關(guān)報(bào)道。本文通過臭靈丹乙醇提取物抑菌作用的實(shí)驗(yàn)研究，比較臭靈丹莖、葉等不同部位的乙醇提取物對(duì)不同細(xì)菌的抑制效果，為臭靈丹藥物療效的進(jìn)一步研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

1.1 材料: 臭靈丹購(gòu)自昆明市官渡區(qū)綠生藥業(yè)有限公司;金黃色葡萄球菌(S.aureus)銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、大腸埃希菌(E.coli)由大理學(xué)院病原生物學(xué)綜合實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑: 95%乙醇為分析純(天津市化學(xué)試劑廠);MH(A)培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司);MH 肉湯(杭州天和微生物試劑有限公司);氯化鈉(原天津市化學(xué)試劑三廠)。

1.3 儀器: SY8200T 型超聲波清洗器(上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司);RE52 -3 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海瀘西分析儀器有限公司);GHP-9160 型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器科學(xué)有限公司);JJ -CJ -2FD 超凈工作臺(tái)(蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司);YXQ -LS -50SII 型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);DHP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);JA3102 電子天平(上海海康電子儀器廠);DP04224 微量加樣槍;50 分度游標(biāo)卡尺。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 臭靈丹乙醇提取物制備: 稱取臭靈丹粉末葉1400g、莖2000g，用95%乙醇(藥材的10 倍量)超聲波處理1h，靜置5min，過濾，濾渣用95%乙醇(藥材的2 倍量)超聲波處理30min，靜置5min，過濾，收集兩次濾液，減壓濃縮至無醇味。

在臭靈丹濃縮乙醇提取液中加入多倍量水稀釋，放置4℃的冰箱6h 后過濾，沉淀物除去樹脂，葉綠素等水不溶性雜質(zhì)，減壓濃縮得到流浸膏［4］，莖為106.10g，提取率為5.305%;葉為113.70g，提取率為8.121%。

以20%乙醇作溶劑溶解臭靈丹乙醇提取物莖、葉，配制成所需濃度［5］。

2.2 菌懸液的制備: 取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌分別接種于MH 瓊脂平板培養(yǎng)基中，于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24h，用接種環(huán)取瓊脂平板上活化的單個(gè)菌落，用5 ～6mL 生理鹽水校正濃度至0.5 麥?zhǔn)媳葷釂挝弧?/p>

2.3 濾紙擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)研究臭靈丹相對(duì)抑菌活性: 用軋孔器在定性濾紙上軋成直徑為6mm 的小圓片數(shù)片，于120℃條件下高壓滅菌20min。取圓形滅菌濾紙片放入分別裝有臭靈丹莖(1g/mL)、葉(1g/mL)提取液及20%乙醇的試管中浸潤(rùn)，用無菌鑷子取出含藥濾紙片放入培養(yǎng)皿于恒溫箱中烘干5min，備用。

各菌種設(shè)2 個(gè)平行組，臭靈丹莖、葉兩組為實(shí)驗(yàn)組，不含藥液的溶劑為對(duì)照組。用無菌棉簽取已配制好的菌懸液，于MH 瓊脂平板上作來回連續(xù)劃線，使其密集而均勻地涂布于整個(gè)平板表面，置室溫3 ～5min 后。用無菌鑷子分別取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組含藥紙片呈對(duì)稱三角形貼于細(xì)菌平板上。同法取其他細(xì)菌各做1 份，并在平板底面玻璃上注明細(xì)菌及藥物名稱，于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h 后觀察并記錄結(jié)果。

2.4 試管稀釋法測(cè)量臭靈丹對(duì)測(cè)試菌的最低抑菌濃度(MIC): 各菌種設(shè)兩個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)組為臭靈丹莖、葉醇提物兩組，對(duì)照組為不含藥液的溶劑，取10 支試管為一組，編為1 ～10 號(hào)，每支試管加入2mLMH 肉湯培養(yǎng)基，在莖組、葉組、對(duì)照組1 號(hào)試管中分別加入2mL 的4g/mL、2g/mL 制備藥液及20%乙醇溶液，混勻后分別吸取2mL 至2 號(hào)試管，以此類推加至8 號(hào)試管，吸取2mL 棄去。9 號(hào)試管為不含藥液的測(cè)試菌生長(zhǎng)對(duì)照，10 號(hào)試管為不含菌液的陰性對(duì)照。莖組1 ～8 號(hào)試管藥液濃度分別為2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156g/mL;葉組1 ～8 號(hào)試管藥液濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0313、0.0156、0.0078g/mL。用微量加樣器分別取0.1mL 菌懸液依次加到由低濃度藥液到高濃度藥液的各試管中(同法用于各菌)。將每組試管置于37°C 恒溫箱中培養(yǎng)24h，未見細(xì)菌生長(zhǎng)的為最低抑菌濃度(MIC)。

3 結(jié)果與討論

3.1 臭靈丹醇提物的抑菌作用: 見表1。

表1 臭靈丹提取物平均抑菌圈直徑( ±s，mm n=5)

表1 臭靈丹提取物平均抑菌圈直徑( ±s，mm n=5)

組別 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 大腸埃希菌莖醇提物8.916 ±0.113 7.916 ±0.466 6.506 ±0.128葉醇提物 12.712 ±1.008 7.868 ±0.185 6.730 ±0.073溶劑對(duì)照組6.706 ±0.087 6.222 ±0.041 6.276 ±0.043

對(duì)金黃色葡萄球菌: 莖組和乙醇溶劑組的抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);莖組抑菌圈直徑均值更大(8.92mm ＞6.71mm)，有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(12.71mm ＞6.71mm)，有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(12.71mm ＞8.92mm)，葉醇提物抑菌作用比莖更明顯。

對(duì)銅綠假單胞菌: 莖組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)莖組抑菌圈直徑均值更大(7.92mm ＞6.22mm)，具有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，葉組的抑菌圈直徑均值更大(7.87mm ＞6.22mm)，具有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.798 ＞0.05)，莖、葉醇提物抑菌作用無顯著性差異。

對(duì)大腸埃希菌: 莖組和乙醇溶劑組的抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.01 ＜0.05)且莖組抑菌圈直徑均值更大(6.51mm ＞6.28mm)，莖醇提物具有顯著抑菌作用;葉組和乙醇溶劑組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大(6.73mm ＞6.28mm);葉醇提物具有顯著抑菌作用;莖組和葉組抑菌圈直徑差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.02 ＜0.05)且葉組抑菌圈直徑均值更大6.73mm ＞6.51mm。葉醇提物抑菌作用比莖更明顯。

3.2 莖、葉提取物對(duì)3 種菌的最小抑菌濃度(MIC): 在莖組實(shí)驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的澄清管為1 ～2 號(hào)，混濁管為3 ～9 號(hào)，MIC 為2 號(hào)管濃度，即為1g/mL;銅綠假單胞菌的澄清管為1 ～2 號(hào)，混濁管為3 ～9 號(hào)，MIC 為2 號(hào)管濃度，即為1g/mL;大腸埃希菌的澄清管為1 號(hào)，混濁管為2 ～9號(hào)，MIC 為1 號(hào)管濃度，即為2g/mL。

在葉組實(shí)驗(yàn)中，金黃色葡萄球菌的澄清管為1 ～4 號(hào)，混濁管為5 ～9 號(hào)，MIC 為4 號(hào)管濃度，即為0.125g/mL;銅綠假單胞菌的澄清管為1 ～2 號(hào)，混濁管為3 ～9 號(hào)，MIC 為2 號(hào)管濃度，即為0.5g/mL;大腸埃希菌的澄清管為1 ～2號(hào)，混濁管為3 ～9 號(hào)，MIC 為2 號(hào)管濃度，即為0.5g/mL。

在乙醇溶劑對(duì)照組實(shí)驗(yàn)中，僅金黃色葡萄球菌的1 號(hào)管與銅綠假單胞桿菌的1 號(hào)管曾出現(xiàn)過澄清溶液，其余管溶液皆混濁。因此，能進(jìn)一步支持本實(shí)驗(yàn)忽略溶劑對(duì)抗菌效果測(cè)定的干擾。

4 結(jié) 論

本研究顯示: 臭靈丹醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌均有抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用較強(qiáng)，對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用較弱;臭靈丹葉醇提物的抑菌作用強(qiáng)于莖醇提物，臨床上葉入藥可以獲得更好的抑菌療效。

［1］中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志( 第75卷) ［M］.北京：科學(xué)出版社，1979.46.

［2］趙杰，毛曉健，楊天梅，等.淺談臭靈丹的藥理作用［J］.中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2(8) ： 14.

［3］姜北，段寶忠.白族慣用植物藥［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2014.324 -326.

［4］吳立軍.天然藥物化學(xué)( 第六版) ［M］. 北京： 人民衛(wèi)生出版社，2011.24.

［5］邊藏麗，邊麗梅.乙醇對(duì)常見病原菌最低殺菌濃度的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中華臨床醫(yī)藥雜志，2002，3(6) ：41 -42.