蔣永亮 聶 金 劉 蕾 戴愛國

（湖南省老年醫(yī)院呼吸疾病研究所，長沙 410001）

慢性肺源性心臟?。ê喎Q肺心?。┦菄?yán)重危害健康的常見病。在我國85%的肺心病由慢性阻塞性肺疾?。–OPD）發(fā)展而來。其中肺動脈高壓是肺心病的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)，而缺氧又是形成肺動脈高壓的重要因素，因此缺氧性肺動脈高壓（HPH）的發(fā)病機(jī)制及防治一直是人們研究的熱點(diǎn)。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMC）的凋亡與增殖失衡是低氧性肺血管重塑發(fā)生發(fā)展的重要細(xì)胞機(jī)制［1，2］，而低氧誘導(dǎo)因子－1（hypoxia－inducible factor－1，HIF－1）則是導(dǎo)致此平衡失調(diào)的重要分子機(jī)制［3－5］。HIF－1表達(dá)分布、時(shí)相及對目標(biāo)基因iNOS、VEGF、HO－1等表達(dá)的調(diào)控均有明顯差異，提示HIF－1是低氧性肺血管重塑形成中調(diào)控目標(biāo)基因表達(dá)的“分子開關(guān)”［6］。

HIFs家族是由不同的α亞基（HIF－1α、HIF－2α、HIF－3α）和共同的β亞基構(gòu)成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF－α亞單位氧依賴性降解有賴于其ODD區(qū)特定脯氨酸殘基羥基化，羥基化后的HIF－α可 與 腫 瘤 抑 制 蛋 白 pVHL（von Hippel－Lindau tumour suppressor protein）結(jié)合，通過E3蛋白酶體途徑快速降解。有研究表明，氧感受器－HIF脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase domain－containing proteins，PHDs）是催化特定脯氨酸殘基羥基化的關(guān)鍵，是 HIF－α氧依賴性降解的限速酶［7］。

在人類共有三種2－酮戊二酸依賴的脯氨酰羥化酶被確認(rèn)（PHD1－3）。PHDs催化 HIF－1α亞基402和（或）564位脯氨酰殘基羥基化是其與pVHL結(jié)合的識別信號，二者的結(jié)合啟動了HIF－1α的降解過程。研究發(fā)現(xiàn)多種生物分子可通過不同途徑來調(diào)節(jié)PHDs的表達(dá)與酶活性從而影響HIFs的表達(dá)［8］。

新發(fā)現(xiàn)一種候補(bǔ)腫瘤抑制蛋白ING4（Inhibitor of growth family member 4）具有與PHD家族相類似的鋅指結(jié)構(gòu)并參與腫瘤生成，細(xì)胞凋亡，DNA修復(fù)以及細(xì)胞周期控制等一系列過程［9］。通過酵母雙雜交作用證明ING4可與PHD2相結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)HIFs的轉(zhuǎn)錄活性。

研究以大鼠HPH模型為對象，探討肺動脈高壓形成過程中ING4表達(dá)變化的規(guī)律及和PHDs、HIF－α之間的相關(guān)關(guān)系，闡明ING4調(diào)控PHDs蛋白表達(dá)與酶活性在HPH發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)動物

健康雄性二級Wistar大鼠40只，體重270±30 g，10－12w，由湖南中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，清潔級，證書號：036，發(fā)證單位：湖南省實(shí)驗(yàn)動物管理委員會。

2.實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大鼠缺氧性肺動脈高壓模型的復(fù)制及分組

按隨機(jī)數(shù)字法將大鼠分為5組，每組8只：對照組（對照組），缺氧3d、7d、14d和21d組（H3、H7、H14和 H21組）。按本室報(bào)道的方法［10］，每天8h間斷缺氧（氧濃度10%±0.5%，氣壓與大氣壓相等）。對照組置于正常氧濃度的空氣艙內(nèi)，其余各飼養(yǎng)條件完全相同。

2.2 肺動脈壓力測定

大鼠經(jīng)1%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉后，按徐平等報(bào)道方法［11］通過壓力傳感器接上Powerlab（美國匹茲堡AD器械有限公司）連續(xù)測壓并計(jì)算大鼠平均肺動脈壓力（mean pulmonary artery pressure，mPAP）。

2.3 右室肥厚指數(shù)（RVHI）的測定

肺動脈測壓后將大鼠放血處死，取出心臟置4%中性甲醛固定48h，沿房室溝切除心房及大血管根部，再沿到后室間溝將右心室游離壁分離，吸干水分后分別稱取右室（RV）和左室＋室間隔（LV＋S）的重量，計(jì)算右室肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RVHI）反映右心室肥厚的變化。

2.4 肺小血管形態(tài)學(xué)分析

大鼠左上側(cè)肺組織做石蠟切片，每只大鼠隨機(jī)選3張肺組織切片，每張切片選取斷面積較圓的直徑100μm左右肺細(xì)小動脈5支，用病理圖像分析軟件（朗珈PAS9000病理圖像分析系統(tǒng)）測定肺動脈管壁面積/管總面積（WA%），管腔面積/管總面積（LA%），作為肺小血管重塑指標(biāo)［12］。

3.HIF－1α、PHDs、ING4原位雜交及結(jié)果分析

地高辛標(biāo)記的多相寡核苷酸探針（武漢博士德生物工程有限公司提供）序列：

參照文獻(xiàn)［2］，取大鼠左下肺組織和臨床肺組織標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛/0.1mol/L PBS固定2h，常規(guī)脫水、浸蠟、包埋；石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，胃蛋白酶37℃消化20min以暴露mRNA核酸片段，38℃濕盒內(nèi)預(yù)雜交2h后加雜交探針，蓋上硅化蓋玻片置38℃濕盒內(nèi)雜交16h；在干燥環(huán)境中繼續(xù)雜交2h，洗滌、封閉，按說明書依次加入地高標(biāo)記兔抗大鼠抗體、生物素化羊抗兔抗體、SABC（鏈親和素－過氧化物酶溶液），DAB（二甲氨基偶氮苯）顯色；蘇木素復(fù)染，脫水透明常規(guī)封閉觀察。以不含探針的雜交液代替探針作陰性對照，在顯微鏡下根據(jù)著色程度判定陽性強(qiáng)度：（1）陰性（－）：無黃色；（2）弱陽性（＋）：淡黃色；（3）陽性（＋＋）：黃色；（4）強(qiáng)陽性（＋＋＋）：深黃色或黃褐色。標(biāo)定陰性背景顏色和陽性信號顏色，用肺動脈壁圖像分析軟件檢測肺細(xì)小動脈管壁平均吸光度（absorbance，A），作為衡量陽性信號強(qiáng)弱的指標(biāo)。

4.HIF－1α、PHDs、ING4免疫組織化學(xué)檢測

參照文獻(xiàn)［13］，取大鼠左上側(cè)肺組織和臨床肺組織標(biāo)本經(jīng)中性緩沖甲醛固定12h，常規(guī)脫水，浸蠟、石蠟包埋；加50μl過氧化酶阻斷溶液室溫下孵育10min，0.125%胰蛋白酶37℃處理20min行抗原修復(fù)，非免疫動物血清室溫下孵育5min，加一抗：兔抗大鼠多克隆抗體，1∶150稀釋。4℃孵育過夜，PBS沖洗，然后按試劑盒說明依次滴加二抗，SABC，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹脂膠封片觀察，陽性結(jié)果（主要在胞漿）顯棕黃色，以PBS代替一抗作陰性對照。每只大鼠取2張肺組織切片，每張切片隨機(jī)選取直徑100－150μm的肺動脈3支，管壁各指標(biāo)蛋白相對含量檢測同上。

5.Western blot檢測肺動脈 HIF－1α、PHDs、ING4蛋白質(zhì)表達(dá)

取大鼠肺內(nèi)動脈，剪碎加入1mL改良RIPA裂解液，冰浴條件下勻漿；4℃10 000g離心，棄除沉淀，上清液即為總蛋白。每孔加入等量蛋白質(zhì)樣品，7.5%十二烷基硫酸鈉－丙烯酰胺凝膠200伏恒壓電泳后，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2h后，與1∶1 000稀釋的一抗（購自Santa Cruz公司）4℃溫育過夜。封閉液漂洗后加入1∶2 000稀釋的二抗（公司同上），室溫下?lián)u床雜交1h。漂洗后增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法發(fā)光，X線膠片顯影，圖像分析系統(tǒng)（上海Tanon Gis22010）對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度半定量，計(jì)算待測條帶的吸光度與內(nèi)參照β－actin的吸光度比值。

6.RT－PCR測肺動脈中HIF－1α、PHDs、ING4mRNA

取大鼠肺動脈，按說明書用TRIZOL試劑（上海生工）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR，擴(kuò)增引物由上海生工公司合成，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，適宜溫度退火30s，72℃延伸60s，反應(yīng)適當(dāng)循環(huán)后72℃延伸10min。RTPCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 的瓊脂糖凝膠（含0.5μg/ml溴化乙啶）電泳，凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海Tanon Gis22010）對擴(kuò)增產(chǎn)物條帶吸光度半定量，計(jì)算待測條帶的吸光度與內(nèi)參照β－actin的吸光度比值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS11.5軟件，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，多樣本均數(shù)組間比較采用q檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)回歸法。P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性，P＜0.01認(rèn)為差異有高度顯著性。

結(jié) 果

1.不同缺氧時(shí)間對低氧性肺動脈高壓模型大鼠mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，mPAP從缺氧7d起較對照組明顯增高（P＜0.05），14d達(dá)高水平，21d保持在高水平；RVHI則從缺氧14d起較對照組明顯升高（P＜0.05），已形成右心室肥厚。光鏡下缺氧7d可見直徑100μm左右的小動脈中層平滑肌增生，管壁變厚，管腔變窄，缺氧14d和21d平滑肌增生顯著，管腔進(jìn)一步狹窄。（表1）

表1 不同缺氧時(shí)間對低氧性肺動脈高壓模型大鼠mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑的影響Table1 Histological and non－h(huán)istological parameters for rats exposed to normoxia or hypoxia

2.不同缺氧時(shí)間對肺小動脈壁ING4mRNA及蛋白的表達(dá)的影響

原位雜交顯示（Table2），對照組大鼠肺小血管ING4mRNA呈弱陽性表達(dá)，缺氧3d后開始增高，缺氧7d達(dá)高峰，缺氧14d和21d表達(dá)下降但仍高于對照組（Fig.4）。RT－PCR顯示肺動脈ING4mRNA表達(dá)與原位雜交變化趨勢一致（Fig.1）。免疫組化顯示對照組大鼠肺小血管壁ING4缺氧7d表達(dá)明顯增高，缺氧14d 達(dá)高峰（Table2，F(xiàn)ig.3）。Western blots顯示ING4蛋白變化趨勢與免疫組化變化趨勢一致（Fig.2）。

表2 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈壁ING4和HIF－1αmRNA及蛋白的表達(dá)的影響Table2 Effects of different hypoxia time periods on expression of HIF－1αand ING4in pulmonary artery of rats.

圖1 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈ING4、HIF－1α和PHD1－3mRNA的表達(dá)的影響Fig.1 Reverse transcription－polymerase chain reaction analysis of ING4、HIF－1αand PHD1－3mRNA levels in rat lung arteries during normoxia（control）and hypoxia（3，7，14and 21d）.The amplification ofβ－actin was used as a control.

圖2 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈ING4、HIF－1α和PHD1－3蛋白的表達(dá)的影響Fig.2 Western blot analysis of ING4、HIF－1αand PHD1－3levels in rat lung arteries during normoxia（control）and hypoxia（3，7，14and 21d）.The amplification ofβ－actin was used as a control.

圖3 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈ING4蛋白的表達(dá)的影響Fig.3 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor ING4protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）.DAB，×400.

圖4 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈ING4mRNA表達(dá)的影響Fig.4 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor ING4mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure1dwith administrati to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E），×400.■

圖5 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈HIF－1αmRNA表達(dá)的影響Fig.5 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor（HIF）－1αmRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure1dwith administrati to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

圖6 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈HIF－1α蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor（HIF）－1αprotein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

圖7 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈PHD1mRNA表達(dá)的影響Fig.7 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）1mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E），or hypoxia for 21d

圖8 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈PHD1蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein （PHD）1protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d

3.不同缺氧時(shí)間對肺小動脈壁HIF－1αmRNA及蛋白的表達(dá)的影響

RT－PCR及 原 位 雜 交 顯 示 （Table2），HIF－1α mRNA在缺氧3d和7d相對量無明顯變化，缺氧14d后表達(dá)略增高（P＜0.05）（Fig.1，5），主要見于肺小動脈中膜平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜細(xì)胞。Western blot中HIF－1α蛋白在缺氧3d組蛋白質(zhì)明顯升高，缺氧7d達(dá)高峰，此后保持高水平（Fig.2）。免疫組化示HIF－1α蛋白對照組支氣管上皮呈陽性表達(dá)，缺氧3d肺小動脈中膜和內(nèi)膜明顯升高，7d達(dá)到高峰（Fig.6），隨后缺氧14d和21d組水平下降。

4.不同缺氧時(shí)間對肺小動脈壁PHDs mRNA及蛋白的表達(dá)的影響

原位雜交（Table3）顯示，對照組大鼠肺小血管PHD1mRNA呈陽性表達(dá)（Fig.7），缺氧后與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。RT－PCR顯示肺動脈PHD1mRNA表達(dá)與原位雜交變化趨勢一致（Fig.1）。免疫組化顯示對照組大鼠肺小血管壁PHD1呈陽性表達(dá)，缺氧3d、7d后無明顯變化，缺氧14d較對照組顯著下降（P＜0.05），缺氧21d維持較低水平（Fig.8）。Western blot顯示PHD1蛋白變化趨勢與免疫組化變化趨勢一致（Fig.2）。

原位雜交顯示，對照組大鼠肺小血管PHD2mRNA呈弱陽性表達(dá)，缺氧3d增高，缺氧14 d達(dá)高峰，缺氧21d保持高水平（Fig.9）。RT－PCR顯示肺動脈PHD2mRNA表達(dá)與原位雜交變化趨勢一致（Fig.1）。免疫組化顯示對照組大鼠肺小血管壁PHD2缺氧3d表達(dá)增高，缺氧14d達(dá)高峰，缺氧21d保持較高水平（Fig.10）。Western blots顯示PHD2蛋白變化趨勢與免疫組化變化趨勢一致（Fig.2）。

表3 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈壁PHDs mRNA及蛋白的表達(dá)的影響Table3 Effects of different hypoxia time periods on expression of PHDs in pulmonary artery of rats

原位雜交顯示，對照組大鼠肺小血管PHD3mRNA呈弱陽性表達(dá)，缺氧3d增高，缺氧14 d達(dá)高峰，缺氧21d保持高水平（Fig.11）。RTPCR顯示肺動脈PHD3mRNA表達(dá)與原位雜交所觀察到的肺小血管mRNA變化趨勢一致（Fig.1）。免疫組化顯示對照組大鼠肺小血管壁PHD3呈弱陽性表達(dá)，缺氧3d表達(dá)增高，缺氧7d保持高水平，缺氧14d和21d略有下降但仍高于對照組（Fig.12）。Western blots顯示PHD3蛋白變化趨勢與免疫組化變化趨勢一致（Fig.2）。

5.ING4蛋白質(zhì)與 HIF－1α、PHDs、mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑蛋白質(zhì)相關(guān)性

直線相關(guān)分析表明，在缺氧組大鼠中MORG1蛋白質(zhì)與 HIF－1α、PHD3蛋白質(zhì)及 mPAP、RVHI、WA%呈正相關(guān)，ING4蛋白質(zhì)與HIF－1α蛋白質(zhì)及mPAP、RVHI、WA%呈負(fù)相關(guān)（Table4）。

表4 ING4蛋白質(zhì)與HIF－1α、PHDs、mPAP、右心室肥厚及肺血管重塑蛋白質(zhì)相關(guān)性分析Table4 Linear correlation analysis between ING4proteins and HIFs－α、PHDs proteins，RVHI，mPAP，WA%，LA%，PAMT

圖9 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈PHD2mRNA表達(dá)的影響Fig.9 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）2mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）DAB，400×.

圖10 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈PHD2蛋白表達(dá)的影響Fig.10 Immunohistochemistry analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）2protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

圖11 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈PHD2mRNA表達(dá)的影響Fig.11 In situ hybridization analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein （PHD）3mRNA expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）DAB，400×.

圖12 不同缺氧時(shí)間對肺小動脈PHD3蛋白表達(dá)的影響Fig.12 Immuno－h(huán)istochemistry analysis of hypoxia－inducible factor prolyl hydroxylase domain－containing protein（PHD）3protein expression in rat pulmonary arteries after exposure to hypoxia for 0d（A）（control），3d（B）and 7d（C），14d（D），21d（E）

討 論

COPD患者后期由于長期的慢性缺氧，可導(dǎo)致肺小動脈痙攣、收縮以及結(jié)構(gòu)重塑，肺動脈壓升高及肺血管阻力增加，右心后負(fù)荷加重，最終導(dǎo)致右心室肥厚、肺心病。本實(shí)驗(yàn)對大鼠進(jìn)行缺氧處理，大鼠mPAP于缺氧7d顯著升高，同時(shí)出現(xiàn)HPVR，隨著缺氧時(shí)間進(jìn)一步延長，mPAP繼續(xù)增高，HPVR加重，并出現(xiàn)RVHI增加。說明缺氧是形成肺動脈高壓和肺血管重塑的重要原因，本實(shí)驗(yàn)所復(fù)制的大鼠模型可作為研究COPD患者HPH發(fā)病機(jī)制的動物模型。

本室近年研究表明，HIFs在缺氧大鼠和慢性阻塞性肺疾病患者的HPH發(fā)病中起著重要作用。而PHDs作為細(xì)胞氧感受器，通過羥基化HIFs特定部位的脯氨酸殘基使其進(jìn)行泛素化降解，而在機(jī)體氧濃度和HIFs穩(wěn)定性協(xié)調(diào)中也發(fā)揮著極其重要的作用［14］。

ING4屬于生長因子抑制劑家族成員，它具有與PHD家族相類似的鋅指結(jié)構(gòu)并參與腫瘤生成、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)以及細(xì)胞周期控制等一系列過程［9，15］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ING4與 PHD2無明顯相關(guān)性，同前期發(fā)現(xiàn)的PHDs調(diào)節(jié)因子 OS－9不同［12］，研究表明ING4并非PHD2的作用底物也不影響其活性表達(dá)，而是兩者結(jié)合后共同抑制 HIF－1募集p300/CBP從而抑制其轉(zhuǎn)錄活性［16］。本試驗(yàn)中ING4蛋白和mRNA水平在缺氧3d和7d后升高，而隨缺氧時(shí)間延長在21d均有所下降但仍高于對照組，關(guān)于ING4的調(diào)節(jié)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

根據(jù)以上結(jié)果推測，大鼠肺動脈高壓模型中ING4、PHDs和HIF－1α的表達(dá)變化可能是缺氧性肺動脈高壓（HPH）發(fā)生發(fā)展的重要發(fā)病機(jī)制。

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