張海濱 王春芳 李鵬飛 劉 佳 張振山 呼鐘理 李 宵

（1山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心；2山西醫(yī)科大學(xué)科研實驗中心，太原 030001；3武警山西總隊直升機(jī)大隊衛(wèi)生所，太原 031818；4太原市中醫(yī)醫(yī)院，太原 030002）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是由各種原因所導(dǎo)致的脊髓部位受損，主要有損傷初期的原發(fā)性損傷和其后由于局部缺血、缺氧、水腫、炎癥等造成的繼發(fā)性損傷。是一種高致殘率的嚴(yán)重?fù)p傷。多年研究證實，神經(jīng)細(xì)胞凋亡所致的神經(jīng)元大量丟失是脊髓損傷的重要病理機(jī)制［1］，而脊髓損傷后會導(dǎo)致?lián)p傷部位以下神經(jīng)支配區(qū)域肢體出現(xiàn)截癱，如何有效抑制受損部位神經(jīng)細(xì)胞的凋亡、促使神經(jīng)細(xì)胞再生、軸突再生、準(zhǔn)確定位軸突生長方向及恢復(fù)受損部位功能是目前治療脊髓損傷面臨的主要困難［2］及研究方向。神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是一類存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)具有高度增殖、自我更新及分化能力，在一定條件下能分化形成神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞的原始母細(xì)胞。正常狀態(tài)下NSCs處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，在一定誘導(dǎo)條件下可發(fā)生增殖、遷移和分化，具有高度自我更新能力、多潛能分化、低免疫原性和遷移功能等特性［3］。Nestin即巢蛋白，是一種胚胎中間絲（intermediate filament）蛋白，常用來標(biāo)記干細(xì)胞或祖細(xì)胞［4］。是神經(jīng)上皮干細(xì)胞的特異性抗原［5］，在神經(jīng)發(fā)生過程中一過性表達(dá)，被認(rèn)為是NSCs的標(biāo)志。

SCI后局部組織情況復(fù)雜，目前的臨床治療手段尚未能夠起到顯著地治療作用，但隨著技術(shù)的進(jìn)步和儀器的改良，干細(xì)胞移植為治療SCI提供了新的思路。本文即通過改良的Allen＇s法模擬一種貼近、可靠、簡便、重復(fù)性好的小鼠脊髓損傷模型，并通過損傷局部注入NSCs研究其對小鼠脊髓損傷恢復(fù)的影響。

材料和方法

1.主要材料與試劑

FVB小鼠、昆明鼠（山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）；DMEM/F12培養(yǎng)基、EGF、FGF、熒光定量PCR試劑（Life Technologies）；腦立體定位儀（深圳沃瑞德）；微量注射器（33G，10μl，瑞士漢密爾頓）；Stepone Plus PCR擴(kuò)增儀（ABI）；熒光顯微鏡、倒置顯微鏡（OLYMPUS）；體視顯微鏡（COIC）；HE染色試劑盒（北京索萊寶）；Nestin兔抗鼠一抗、Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京博奧森）。

2.小鼠SCI模型的建立

將腦立體定位儀持物桿取下，代以特制內(nèi)含10 g砝碼的重物打擊桿，將砝碼用線相連并將線上標(biāo)明長度，線上升距離即砝碼升高距離，以此控制打擊高度和重量，制成改良Allen＇s脊髓打擊模型（圖1）。成年FVB小鼠50只，雌雄不拘，體重25－30g，隨機(jī)分為空白組（5只）、模型組（15只）、對照組（15只）、治療組（15只）?？瞻捉M不予任何處理；模型組只進(jìn)行脊髓打擊損傷；對照組損傷后局部注入PBS；治療組進(jìn)行NSCs移植。用10%水合氯醛3mg/kg小鼠腹腔注射，麻妥后，用電剃刀剔除背部正中被毛。俯臥位固定小鼠四肢，常規(guī)消毒，沿肋骨可觸及到第13肋所對第13胸椎，由此向上約1cm做縱向切口，分離皮膚，皮下組織，頸部可見脂肪組織，沿肌肉走行分離脊椎旁肌肉組織，暴露T9、10、11椎體（T9棘突向尾部延伸、T11棘突向頭部延伸），用鼠齒鑷略夾起T9椎體上段，沿T11節(jié)段用小紋式鉗掰除椎板，暴露T9至T11節(jié)段脊髓，術(shù)中可用體視顯微鏡協(xié)助操作。將充分暴露的脊髓置于改良Allen＇s打擊模型下，用10g×1.5cm對脊髓打擊，以小鼠痙攣性擺尾，雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓為造模成功標(biāo)志。迅速移開打擊物。此時可見硬脊膜完整，脊髓充血呈暗紅色（圖2）。造模成功后檢查出血并止血，溫鹽水沖洗傷口，逐層縫合肌肉、皮膚，傷口消毒，每日2次腹腔注射青霉素2U。每日3次按摩膀胱，協(xié)助排尿。

3.NSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定

取孕14－16d昆明鼠，麻醉后取胎鼠，于體視顯微鏡下沿背側(cè)正中取出胎鼠脊髓，放入4℃預(yù)冷DHanks液中，沖洗、吸管吹打，使脊髓分離成單個細(xì)胞或組織團(tuán)塊，將細(xì)胞懸濁液1500r/min離心5 min，棄上清，沉淀加入含EGF、FGF各20ng/ml的DMEM/F－12中培養(yǎng)，重懸計數(shù)后按4×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，每3d半量換液。待形成神經(jīng)干細(xì)胞克隆球后進(jìn)行Nestin免疫熒光檢測。

4.NSCs移植

模型制備后對照組于打擊局部注入5μl PBS，治療組局部注入5μl濃度約為2×106/μl的NSCs，采用10μl微量注射器，向頭側(cè)45°進(jìn)針，深度1.5mm，于5min注射完畢，留針5min。

5.病理學(xué)檢測

于損傷后7d麻醉小鼠，4%多聚甲醛心臟灌注后取出T9－T11節(jié)段脊髓，4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋，切片。

HE染色：切片常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染液5 min，蒸餾水沖洗，分化液分化30s，蒸餾水浸泡15 min，伊紅染液2min，蒸餾水沖洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

免疫熒光檢測：切片常規(guī)脫蠟至水，熱修復(fù)15 min，PBS洗滌5min×3次，5%山羊血清封閉20 min，加Nestin抗體（1∶200）50μl，4℃過夜。PBS洗滌5min×3次，加二抗（1∶200），室溫孵育1.5h，PBS洗滌5min×3次，hochest（1∶1000）復(fù)染30 min，PBS洗滌5min×3次，甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

6.Nestin檢測

組織RNA提取：移植7d后將損傷節(jié)段脊髓組織取出，Trizol充分混勻，靜置5min，加200μl氯仿，震蕩，待乳化后靜置3min，12 000g離心15 min，將上層無色液體移至新EP管中，加入500μl異丙醇，混勻，室溫靜置10min，12 000g離心10 min，棄去上清液，加入75%酒精1ml，懸浮沉淀，7500g離心5min，棄上清，常溫干燥5min。

反轉(zhuǎn)錄：將得到的組織RNA等比例加入Oligo（dt）18primer 1μl，RNase free d H2O 5μl，RNA 1 μl，70℃保溫10min，冰上急冷2min，等比例加入5×M－MLV Buffer 2μl，dNTP Mixture 0.5μl，RNase Inhibitor 0.25μl，RTase－MLV 0.25μl，42℃保溫1h，70℃保溫15min，冰上急冷，得到的cDNA于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR檢測：本實驗引物采用ABI Primer express3.0軟件設(shè)計，序列如下：

Gene Primers sequences（5＇－3＇）Nestin Forward：GGTCACTGTCGCCGCTACTC Reverse：GGTCACTGTCGCCGCTACTC β－actin Forward：CCAGTTCGCCATGGATGAC Reverse：ATGCCGGAGCCGTTGTC

利用ABI Stepone Plus定量PCR以進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)液為：SYBR Select Master Mix 10μl，引物0.6μl，dH2O 9μl，cDNA 0.4μl。每空設(shè)置2個重復(fù)，以β－actin為內(nèi)參，擴(kuò)增條件為：95℃2min，后95℃15Ls，58℃30Ls，72℃1min重復(fù)40次循環(huán)，應(yīng)用Applied Biosystems StepOneTM Real－Time PCR Sys－tem Software所提供的Study軟件進(jìn)行定量分析。

7.統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.脊髓損傷模型的建立及行為學(xué)變化

所有實驗小鼠在打擊后均出現(xiàn)痙攣性擺尾，雙下肢及軀體回縮撲動后雙下肢癱瘓，損傷節(jié)段脊髓硬膜完整、出血、水腫（圖2）。模型制作中死亡小鼠6只，后續(xù)補(bǔ)上。

所有麻醉后小鼠于術(shù)后2h左右蘇醒，出現(xiàn)雙下肢癱瘓，運(yùn)動、感覺功能喪失，依靠雙上肢移動軀體，頭頸部活動正常。術(shù)后1d小鼠BBB評分均小于1分，活動明顯減少，進(jìn)食、飲水量減少，45只脊髓損傷小鼠中33只（73.3%）出現(xiàn)排尿困難，需協(xié)助排尿。7d后大部分小鼠恢復(fù)自主排尿功能，可見下肢關(guān)節(jié)輕微活動，治療組評分高于模型組及對照組（P＜0.05）。模型組和空白組之間無顯著差異。

表1 不同時間點(diǎn)各組BBB評分比較（±s）Table1 Comparision of BBB scores in each group（±s）

表1 不同時間點(diǎn)各組BBB評分比較（±s）Table1 Comparision of BBB scores in each group（±s）

注：＊與對照組相比P＜0.05；＃與模型組相比P＜0.05＊P＜0.05，compared with control group；＃P＜0.05，compared with model group.

分組Groups 1d 3d 7d 14d 21d空白組Blank group 21 21 21 21 21模型組 Model group 0.80±0.78 1.33±0.72 1.40±0.63 2.20±0.78 2.53±1.06對照組control group 0.47±0.52 1.07±0.59 1.27±0.80 2.20±0.77 2.27±0.88治療組Treatment group 0.53±0.64 1.13±0.64 1.53±0.74 3.07±1.03＊＃ 3.93±0.96＊＃

2.NSCs的鑒定

采用免疫熒光法檢測所培養(yǎng)至第三代NSCs，可見大量Nestin表達(dá)陽性細(xì)胞呈細(xì)胞球樣聚集（圖3），說明所培養(yǎng)為神經(jīng)干細(xì)胞。

圖3 圖3：免疫熒光染色可見神經(jīng)干細(xì)胞球內(nèi)細(xì)胞胞漿呈Nestin陽性（綠色）×400Fig.3 Fluorescent image of NSCs was showed the cytoplasm immunopositive for Nestin（green）×400

3.組織學(xué)鑒定

3.1 HE染色

于損傷節(jié)段中央管周圍、灰白質(zhì)交界處可見空白組脊髓結(jié)構(gòu)形態(tài)完整，組織結(jié)構(gòu)致密，神經(jīng)纖維排列整齊，神經(jīng)細(xì)胞胞核圓大，核仁清晰，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤（圖4A）。脊髓損傷后可見脊髓實質(zhì)內(nèi)灶、片狀出血，神經(jīng)細(xì)胞核碎裂，組織結(jié)構(gòu)疏松、水腫，灰質(zhì)、白質(zhì)界限模糊并有大量空泡變性。損傷處可見膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及炎性細(xì)胞浸潤（圖4B、C）。治療組較模型組及對照組結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞數(shù)量增多，出現(xiàn)體積小、分化程度低的有核細(xì)胞，且部分胞漿向神經(jīng)細(xì)胞不同階段分化（圖4D）。

3.2 免疫熒光檢測

治療組Nestin熒光檢測可見散在分布的陽性細(xì)胞，較空白組、模型組、對照組顯著增多（圖5）。

4.Nestin檢測

實時定量PCR結(jié)果顯示：四組樣本中治療組表達(dá)量最高，模型組及對照組較空白組表達(dá)量高，且治療組與其他各組兩兩間均存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

圖6 Nestin擴(kuò)增曲線。（1：對照組；2：治療組；3：空白組；4：模型組）Fig.6 The PCR amplification cure of Nestin.（1：Control group；2：Treatment group；3：Blank group；4：Model group）

圖7 Nestin相對定量結(jié)果。（a：模型組；b：對照組；c：治療組；d：空白組）＊與對照組相比P＜0.05；＃與模型組相比P＜0.05。Fig.7 The relative quantitative results of gene Nestin.（a：Model group；b：Control group；c：Treatment group；d：Blank group）＊P＜0.05，compared with Control group；＃P＜0.05，compared with Model group.

討 論

SCI后發(fā)生肢體截癱是醫(yī)學(xué)界多年來難以攻克的治療難題，大量研究表明，SCI后的截癱與局部神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞壞死、凋亡，軸突出現(xiàn)脫髓鞘和變性密不可分［6］。如何提高損傷部位神經(jīng)細(xì)胞的存活率，防止神經(jīng)細(xì)胞喪失成為近年來研究的熱點(diǎn)。很長一段時間，人們認(rèn)為神經(jīng)細(xì)胞是非可再生細(xì)胞，但各種干細(xì)胞的出現(xiàn)給了研究者對神經(jīng)細(xì)胞再生修復(fù)的希望。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對NSCs的研究已不止于內(nèi)源性NSCs的調(diào)控和誘導(dǎo)再生作用，雖然內(nèi)源性NSCs可以避免免疫排斥和致瘤作用［7］，但成年動物NSCs存在于神經(jīng)系統(tǒng)較深部位且數(shù)量極少，以致NSCs的分離困難較大且對機(jī)體本身的損傷極大。故目前的研究熱點(diǎn)更傾向于外源性NSCs的移植。通過分離胚胎或成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)NSCs，體外培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化，促進(jìn)其增殖并向特定方向生長，使細(xì)胞處于不斷循環(huán)往復(fù)的增殖周期中，形成可供大量使用的神經(jīng)干細(xì)胞系［8］。但與此同時，如何模擬損傷后脊髓局部情況并準(zhǔn)確把握NSCs移植的部位、時間，減低NSCs在體內(nèi)產(chǎn)生的免疫排斥及最大化發(fā)揮外源NSCs的修復(fù)和再生作用成為目前所面臨的主要問題。

本實驗采用改制的腦立體定位儀制備Allen＇s脊髓打擊模型是目前最常用被公認(rèn)的SCI研究模型［9］。該模型可準(zhǔn)確進(jìn)行高度測量并精確瞄準(zhǔn)打擊部位，很大程度上提高了制造SCI模型的一致性和標(biāo)準(zhǔn)性。實驗中以小鼠脊髓打擊后出現(xiàn)痙攣性擺尾，雙下肢及軀體回縮撲動后出現(xiàn)癱瘓，損傷節(jié)段脊髓硬膜完整，但出血、水腫，術(shù)后1dBBB評分小于1分為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，建立了穩(wěn)定性好、重復(fù)性高的脊髓打擊模型。將NSCs移植注入受損脊髓節(jié)段，7d后免疫熒光染色可見到Nestin表達(dá)陽性細(xì)胞增多，且在HE染色切片中受損部位出現(xiàn)核碎裂和組織空泡量減少，說明NSCs于損傷部位存活，并對局部起到修復(fù)作用。SCI后一段時間內(nèi)BBB評分逐漸增高，且所有小鼠運(yùn)動功能在一定程度上均有所恢復(fù)，說明受損部位脊髓存在自身修復(fù)作用，但局部注入NSCs的小鼠恢復(fù)速度較模型組和對照組顯著加快（P＜0.05），且最終后肢運(yùn)動情況改善更明顯，說明NSCs可以促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)甚至直接參與到損傷修復(fù)過程。通過熒光定量PCR檢測也可看出SCI后外源性NSCs注入7d時Nestin表達(dá)量可達(dá)到空白組3倍多，也顯著高于模型組和對照組。本實驗為避免NSCs移植對小鼠脊髓的二次損傷，選擇脊髓損傷后即刻移植NSCs，這在很大程度上減少移植帶來的再次損傷作用，相關(guān)研究也證實了其可行性［10］，但也有研究指出［11］：脊髓損傷后24h，損傷處出現(xiàn)急性炎癥反應(yīng)，各種有神經(jīng)毒性作用的炎癥因子（如白細(xì)胞介素－6（IL－6）、腫瘤壞死因子（TNF）等）含量急劇增高，這一時期進(jìn)行NSCs移植存活率較低。脊髓損傷后1w左右移植，NSCs存活較好，并可分化成不同類型神經(jīng)細(xì)胞，因為此時急性炎癥已消退，微環(huán)境進(jìn)入修復(fù)階段，有神經(jīng)生長、營養(yǎng)因子的表達(dá)及微血管的形成，有利于移植細(xì)胞的存活。還有研究發(fā)現(xiàn)，NSCs腦內(nèi)移植后只有1%－3%細(xì)胞可以長期存活［12］，可能是由于在一定時間窗內(nèi)局部微環(huán)境不適合NSCs的存活，因此，選擇最佳的時間窗以提高移植細(xì)胞在新環(huán)境中的存活率，對于研究NSCs移植治療脊髓損傷具有重要意義。而且移植細(xì)胞的存活還與移植細(xì)胞的選擇、移植部位、損傷部位及有效的細(xì)胞用量［13］有密切關(guān)系。

綜上，實驗成功建立了小鼠SCI模型，并通過外源性NSCs于損傷局部注射的方法幫助截癱小鼠一定程度上恢復(fù)了運(yùn)動功能，說明外源性NSCs可以在受損脊髓節(jié)段存活并參與脊髓損傷后局部組織修復(fù)的過程，更進(jìn)一步證實了利用外源性NSCs治療SCI的可行性。為以后進(jìn)行下一步NSCs移植實驗提供了基礎(chǔ)，也提示我們在后續(xù)實驗中需要對移植局部微環(huán)境調(diào)控進(jìn)行深入研究，以期更大程度上提高NSCs移植后的存活率并促進(jìn)運(yùn)動功能進(jìn)一步的恢復(fù)。

［1］Ratan RR，Noble M.Novel multi－modal strategies to promote brain and spinal cord injury recovery.Stroke，2009，40（3suppl 1）：S130－S132

［2］Tewarie RSN，Hurtado A，Bartels RH，et al.Stem cell－based therapies for spinal cord injury.The journal of spinal cord medicine，2009，32（2）：105

［3］Watt FM，Hogan BL.Out of Eden：stem cells and their niches.Science，2000，287（5457）：1427－1430

［4］Lendahl U，Zimmerman LB，McKay RDG.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.Cell，1990，60（4）：585－595

［5］Toda H，Takahashi J，Iwakami N，et al.Grafting neural stem cells improved the impaired spatial recognition in ischemic rats.Neuroscience letters，2001，316（1）：9－12

［6］Tewarie RSN，Hurtado A，Bartels RH，et al.Stem cell－based therapies for spinal cord injury.The journal of spinal cord medicine，2009，32（2）：105

［7］Gage FH，Coates PW，Palmer TD，et al.Survival and differentiation of adult neuronal progenitor cells transplanted to the adult brain.Proceedings of the National Academy of Sciences，1995，92（25）：11879－11883

［8］Shihabuddin LS，Ray J，Gage FH.Stem cell technology for basic science and clinical applications.Archives of neurology，1999，56（1）：29

［9］Abematsu M，Tsujimura K，Yamano M，et al.Neurons derived from transplanted neural stem cells restore disrupted neuronal circuitry in a mouse model of spinal cord injury.The Journal of clinical investigation，2010，120（9）：3255

［10］郭家松，曾園山，李海標(biāo)等.移植神經(jīng)干細(xì)胞促進(jìn)脊髓全橫斷大鼠結(jié)構(gòu)與功能修復(fù)的研究.解剖學(xué)報，2003，34：113－117

［11］Ogawa Y，Sawamoto K，Miyata T，et al.Transplantation of in vitro－expanded fetal neural progenitor cells results in neurogenesis and functional recovery after spinal cord contusion injury in adult rats.Journal of neuroscience research，2002，69（6）：925－933

［12］Lendahl U，Zimmerman LB，McKay RDG.CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.Cell，1990，60（4）：585－595

［13］Savitz SI，Rosenbaum DM，Dinsmore JH，et al.Cell transplantation for stroke.Annals of neurology，2002，52（3）：266－275