張旗等

摘要：采用超聲波輔助溶劑法對(duì)低次煙葉中茄尼醇進(jìn)行提取并通過(guò)硅膠柱層析和重結(jié)晶對(duì)其進(jìn)行純化。由正交試驗(yàn)得出超聲波輔助石油醚提取低次煙葉中茄尼醇的最佳工藝條件為溫度50 ℃，時(shí)間60 min，料液比1∶15（m/V，g∶mL），超聲波功率200 W，在此條件下，茄尼醇提取率達(dá)到0.66%。茄尼醇粗提物經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)含量提高了20%，皂化后產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析進(jìn)行分離，純度達(dá)到81%，產(chǎn)率0.4%。此純度的茄尼醇繼續(xù)用乙醇重結(jié)晶精制，純度可達(dá)到90%，收率86%。

關(guān)鍵詞：茄尼醇；超聲波；提取；純化；低次煙葉

中圖分類(lèi)號(hào)：TQ914.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）06-1402-04

Ultrasonic-assisted Solvent Extraction and Purification of Solanesol from Inferior Tobacco Leaf

ZHANG Qi1，2，HUANG Long1，GAO Zhi-nong2，HUANG Ming1，YAO Yuan-jun1

（1. Technology Center， China Tobacco Hubei Industrial Co. Ltd， Wuhan 430040， China；

2. College of chemistry and molecular sciences， Wuhan University， Wuhan 430072， China）

Abstract： The ultrasonic-assisted solvent extraction of solanesol from inferior tobacco leaf and the purification of solanesol by silica gel column chromatography and crystallization was studied. The results of the rhombic experiments showed that the optimal values of parameters for the ultrasonic-assisted petroleum ether extraction of solanesol from inferior tobacco leaf were extraction temperature 50℃， ultrasonic treatment time 60min， material-solvent ratio 1∶15（g∶mL）， ultrasonic power 200W. Under these conditions， the extraction rate of solanesol reached 0.66%. The solanesol content of crude extract increased about 20% by saponification reaction. The saponated solanesol was separated by silica gel column chromatography， with the purity of separated solanesol of 81% and the productivity of 0.4%. The separated solanesol was further purified by recrystallization with ethanol， with the purity of solanesol of 90% and the yield of 86%.

Key words： solanesol； ultrasonic； extraction； purification； inferior tobacco leaf

茄尼醇是一種天然的不飽和四倍半萜烯醇[1]，分子式C45H74O，相對(duì)分子質(zhì)量631，為白色粉末或蠟狀固體，熔點(diǎn)33 ℃左右，易溶于正己烷、石油醚、丙酮等有機(jī)溶劑而不溶于水，對(duì)紫外光呈現(xiàn)非選擇性吸收，無(wú)旋光性。茄尼醇在化學(xué)和藥物化學(xué)中有著非常重要的作用，是泛醌類(lèi)藥物中間體不可替代的成分，是合成纖維素K2的側(cè)鏈和輔酶Q10以及合成抗?jié)兯幬铩⒖拱┧幬锊豢商娲奶烊辉蟍2，3]。由于茄尼醇屬長(zhǎng)鏈半萜類(lèi)烯醇類(lèi)化合物，其人工合成難度很大，目前只能依賴(lài)從植物葉中提取，主要是從煙草中提取獲得。1956年Rowland等[4]首先在煙草中發(fā)現(xiàn)茄尼醇，其含量占煙草干料總質(zhì)量的0.3%～3.0%。目前茄尼醇在日本、韓國(guó)、西歐及北美均有較大的銷(xiāo)售市場(chǎng)，在國(guó)外現(xiàn)有的提取茄尼醇的技術(shù)中，工藝較為成熟的是日本專(zhuān)利技術(shù)，但該技術(shù)存在原料成本高，生產(chǎn)能耗及三廢高等缺點(diǎn)[5]。我國(guó)煙草行業(yè)每年在種植和加工過(guò)程中產(chǎn)生大量的低次煙葉，約占總量的25%，如何從這部分低次煙葉中提取茄尼醇，降低原料成本，從而更好的利用煙草資源，具有重要的意義。

超聲波在提取天然產(chǎn)物方面的應(yīng)用已日益廣泛[6]，在中藥提取方面已經(jīng)工業(yè)化。超聲波用于煙草成分的提取則有望減少溶劑耗量，縮短萃取時(shí)間，在較低的溫度下就可實(shí)現(xiàn)高的提取率。粗品茄尼醇的純化方法大致有柱層析方法、結(jié)晶、分子蒸餾技術(shù)以及分配逆流色譜等[7-10]，其中柱層析方法對(duì)茄尼醇粗品中性質(zhì)相似的組分有較高的選擇性，能順利分離其他方法難于分離的組分，在茄尼醇精制過(guò)程中具有較大優(yōu)勢(shì)，是切實(shí)有效的純化手段。本研究主要探討利用超聲波輔助技術(shù)提取低次煙葉中的茄尼醇，并采用硅膠柱層析結(jié)合重結(jié)晶的方法對(duì)其進(jìn)行分離純化研究，以期提高煙草資源的利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

煙葉碎片由湖北中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供；無(wú)水乙醇、丙酮、石油醚、正己烷、乙酸乙酯均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)樣品（≥90%）購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，薄層層析硅膠板購(gòu)于青島海洋化工廠分廠，柱層析用硅膠（100～200目）購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；D2010W型電動(dòng)攪拌器（上海司樂(lè)儀器有限公司）；EYEL4型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；FW100型高速粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）；DHG-914385-Ⅲ型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；DZF-6030B型真空干燥箱（上海精密儀器儀表有限公司）；Sartorius BSA423S型精密電子分析天平（上海常衡電子科技有限公司）；Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）。

1.3 方法

1.3.1 煙草原料預(yù)處理 將煙葉碎片在60 ℃下烘3 h，粉碎，過(guò)20目篩，置于密封袋中備用。

1.3.2 茄尼醇粗提方法 精確稱(chēng)取預(yù)先處理過(guò)的樣品10 g置于250 mL圓底燒瓶中，加入一定量的提取溶劑，將燒瓶置于帶恒溫加熱的超聲波發(fā)生裝置中，裝上攪拌裝置及冷凝回流管。打開(kāi)超聲及攪拌裝置，在一定溫度下超聲（40 kHz）攪拌（300 r/min）萃取一定時(shí)間后取下燒瓶，抽濾。濾液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮除去有機(jī)溶劑后，剩余物即為煙草茄尼醇粗提物。

1.3.3 茄尼醇粗提物的皂化 稱(chēng)取10 g茄尼醇粗提物于250 mL圓底燒瓶中，加入100 mL 0.2 mol/L NaOH乙醇溶液，在60 ℃下皂化反應(yīng)2 h，停止反應(yīng)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇得褐色黏稠物，再向燒瓶中加入70 mL去離子水，加熱攪拌并滴加鹽酸調(diào)節(jié)pH 7，用石油醚萃取3次（70 mL×3），合并石油醚層，用去離子水反洗一次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)石油醚萃取液得茄尼醇皂化產(chǎn)物。

1.3.4 茄尼醇含量的測(cè)定 采用高效液相色譜法對(duì)提取物中茄尼醇的含量進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法定量。色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶異丙醇（50∶50體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；柱前壓：60 bar；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。色譜檢測(cè)樣前處理：取適量的茄尼醇待測(cè)樣溶于色譜純度的異丙醇中，過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)樣。

1.3.5 茄尼醇薄層層析定性分析（TLC） 用石油醚溶解茄尼醇樣品，配置成一定濃度的試液，用毛細(xì)管點(diǎn)樣于硅膠層析板，然后將層析板置于混合溶劑中進(jìn)行展開(kāi)，待展開(kāi)溶劑前沿達(dá)到板五分之四處時(shí)取出層析板，待溶劑揮發(fā)后置于碘缸中顯色。通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)樣與測(cè)試樣中展開(kāi)點(diǎn)的相對(duì)位置對(duì)茄尼醇進(jìn)行定性分析。

1.3.6 茄尼醇的純化 首先對(duì)茄尼醇粗提物進(jìn)行硅膠柱層析純化，再進(jìn)行重結(jié)晶精制。柱層析采用干法裝柱，稱(chēng)取一定量在110 ℃活化2 h的層析柱硅膠（100～200目），加入玻璃層析柱中，緩慢加入石油醚，然后加壓趕盡氣泡，注意柱內(nèi)液面須高于硅膠層，待柱子飽和后，放出適量石油醚，使柱內(nèi)液面高度與硅膠層等高，關(guān)閉柱子出液口。準(zhǔn)確稱(chēng)取皂化后茄尼醇粗品，用少量石油醚溶解，然后將樣品溶液均勻滴加到硅膠柱上，打開(kāi)柱子出液口，加入洗脫劑進(jìn)行洗脫。用10 mL的試管進(jìn)行定體積收集洗脫液，并通過(guò)硅膠TLC法定性分析各個(gè)不同時(shí)間段收集到的洗脫液中茄尼醇含量，將主要含茄尼醇的部分合并，濃縮，然后加入結(jié)晶溶劑，在-15 ℃下結(jié)晶，過(guò)濾得到的晶體在室溫真空干燥（20 ℃），即得精制茄尼醇。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄尼醇粗提溶劑的篩選

溶劑篩選試驗(yàn)提取條件為溫度50 ℃，時(shí)間30 min，料液比1∶10（m/V，g∶mL），超聲功率200 W。篩選溶劑分別為正己烷，石油醚，丙酮，乙醇，乙酸乙酯，篩選指標(biāo)為茄尼醇提取率和溶劑價(jià)格。

茄尼醇提取率=■×100%。試驗(yàn)結(jié)果如表1。從表1可以看出，正己烷和石油醚的提取效果最好，乙醇和乙酸乙酯的提取效果較差，其原因是因?yàn)榍涯岽嫉臉O性較小，根據(jù)相似相溶原理，茄尼醇在低極性的溶劑正己烷和石油醚中溶解度較大，在高極性的乙醇和乙酸乙酯中溶解度較小。因此應(yīng)選取極性小的正己烷或石油醚作為提取溶劑。而從溶劑成本上考慮，石油醚作為提取溶劑更加合適。

2.2 超聲波輔助提取最佳工藝條件的確定

通過(guò)預(yù)備試驗(yàn)得到低次煙葉中茄尼醇提取率較大時(shí)各影響因素水平的大致范圍，為確定最佳提取條件，選擇提取溫度、時(shí)間、料液比、超聲波功率作為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平L9（34）正交試驗(yàn)，以茄尼醇粗提物得率作為考察指標(biāo)對(duì)各因素進(jìn)行篩選，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在考察范圍內(nèi)各因素對(duì)茄尼醇提取影響主次順序?yàn)槌暡üβ省⒘弦罕?、提取溫度、提取時(shí)間，最佳提取工藝為溫度50 ℃、時(shí)間60 min、料液比1∶15、超聲波功率200 W。在此條件下進(jìn)行試驗(yàn)茄尼醇提取率達(dá)到0.66%。

2.3 茄尼醇粗提物的皂化結(jié)果

有報(bào)道表明，茄尼醇以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在于煙草中，茄尼醇酯型化合物經(jīng)堿性乙醇溶液皂化可得到脂肪酸和游離的茄尼醇[11]。本試驗(yàn)茄尼醇粗提物浸膏皂化前后經(jīng)過(guò)高效液相色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)茄尼醇含量提高了約18%，皂化前提取率為0.66%，皂化后提取率達(dá)到0.78%。

2.4 茄尼醇的純化結(jié)果

2.4.1 洗脫劑的確定 流動(dòng)相對(duì)化合物的洗脫是流動(dòng)相分子與被分離化合物分子競(jìng)爭(zhēng)吸附到吸附劑（硅膠）表面的過(guò)程。硅膠表面顯極性，因此強(qiáng)極性的流動(dòng)相占據(jù)吸附表面能力強(qiáng)，洗脫能力也強(qiáng)。而目標(biāo)化合物茄尼醇為弱極性物質(zhì)，本身在硅膠表面吸附能力就較弱，為了保證其在吸附劑上有一定的吸附保留時(shí)間，應(yīng)選極性相對(duì)較弱的流動(dòng)相。常用的單一流動(dòng)相按極性排列如下：石油醚<二氯甲烷<氯仿<乙酸乙酯<丙酮<乙醇<甲醇。分別用這幾種單一流動(dòng)相做TLC試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其展開(kāi)效果都不理想，因此選擇混合流動(dòng)相，綜合考慮分離效果、流動(dòng)相的安全性以及價(jià)格最終確定石油醚-乙酸乙酯混合溶劑體系作為流動(dòng)相。圖1為石油醚∶乙酸乙酯體積比為4∶1的混合展開(kāi)劑中茄尼醇標(biāo)準(zhǔn)樣以及測(cè)試樣的對(duì)比TLC圖。左邊為標(biāo)準(zhǔn)樣品茄尼醇展開(kāi)點(diǎn)，右邊與其等高點(diǎn)即為混合物中茄尼醇的展開(kāi)點(diǎn)，由TLC圖可以看出，在此極性混合展開(kāi)劑中茄尼醇基本與其他物質(zhì)分開(kāi)，可以此展開(kāi)體系對(duì)茄尼醇做定性分析。

2.4.2 洗脫劑配比的確定 為了達(dá)到最佳的硅膠柱層析分離效果，分別配制體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%的乙酸乙酯石油醚溶液作為洗脫劑，對(duì)吸附于硅膠柱上茄尼醇粗提物進(jìn)行洗脫試驗(yàn)，洗脫流速控制在4 mL/min（混合物上樣量約2 g）。結(jié)果表明，10%的乙酸乙酯石油醚溶液，即石油醚∶乙酸乙酯為9∶1的洗脫劑對(duì)茄尼醇的分離效果最好。在此條件下層析分離得到的茄尼醇經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)知其純度為81%，產(chǎn)率0.4%。

2.4.3 茄尼醇的精制 通過(guò)對(duì)幾種常見(jiàn)溶劑乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚的篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10倍體積的乙醇在-15 ℃的條件下對(duì)層析純化后的茄尼醇的結(jié)晶效果最好，收率達(dá)到86%，純度達(dá)到90%以上。圖2為標(biāo)準(zhǔn)樣、皂化后以及結(jié)晶精制后的茄尼醇高效液相色譜圖，圖中保留時(shí)間為8.5 min左右處峰即為茄尼醇峰，由圖2可以看出，結(jié)晶精制后茄尼醇的純度已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)樣純度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了低次煙葉中茄尼醇的超聲波輔助提取方法和純化方法。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)以石油醚作為超聲波萃取低次煙草中茄尼醇的溶劑最為合適。由正交試驗(yàn)得出超聲波輔助提取低次煙葉中茄尼醇的工藝優(yōu)化條件為溫度50 ℃，時(shí)間60 min，料液比1∶15，超聲波功率200 W，在此條件下，茄尼醇提取率達(dá)到0.66%。茄尼醇粗提物經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)含量提高了約18%，皂化后產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析進(jìn)行分離，硅膠100～200目，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯為 9∶1，茄尼醇產(chǎn)率0.4%，純度81%。此純度的茄尼醇繼續(xù)用10倍體積的乙醇在-15 ℃的條件下重結(jié)晶精制，純度達(dá)到90%，收率86%。

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2.4.2 洗脫劑配比的確定 為了達(dá)到最佳的硅膠柱層析分離效果，分別配制體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%的乙酸乙酯石油醚溶液作為洗脫劑，對(duì)吸附于硅膠柱上茄尼醇粗提物進(jìn)行洗脫試驗(yàn)，洗脫流速控制在4 mL/min（混合物上樣量約2 g）。結(jié)果表明，10%的乙酸乙酯石油醚溶液，即石油醚∶乙酸乙酯為9∶1的洗脫劑對(duì)茄尼醇的分離效果最好。在此條件下層析分離得到的茄尼醇經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)知其純度為81%，產(chǎn)率0.4%。

2.4.3 茄尼醇的精制 通過(guò)對(duì)幾種常見(jiàn)溶劑乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚的篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10倍體積的乙醇在-15 ℃的條件下對(duì)層析純化后的茄尼醇的結(jié)晶效果最好，收率達(dá)到86%，純度達(dá)到90%以上。圖2為標(biāo)準(zhǔn)樣、皂化后以及結(jié)晶精制后的茄尼醇高效液相色譜圖，圖中保留時(shí)間為8.5 min左右處峰即為茄尼醇峰，由圖2可以看出，結(jié)晶精制后茄尼醇的純度已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)樣純度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了低次煙葉中茄尼醇的超聲波輔助提取方法和純化方法。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)以石油醚作為超聲波萃取低次煙草中茄尼醇的溶劑最為合適。由正交試驗(yàn)得出超聲波輔助提取低次煙葉中茄尼醇的工藝優(yōu)化條件為溫度50 ℃，時(shí)間60 min，料液比1∶15，超聲波功率200 W，在此條件下，茄尼醇提取率達(dá)到0.66%。茄尼醇粗提物經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)含量提高了約18%，皂化后產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析進(jìn)行分離，硅膠100～200目，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯為 9∶1，茄尼醇產(chǎn)率0.4%，純度81%。此純度的茄尼醇繼續(xù)用10倍體積的乙醇在-15 ℃的條件下重結(jié)晶精制，純度達(dá)到90%，收率86%。

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2.4.2 洗脫劑配比的確定 為了達(dá)到最佳的硅膠柱層析分離效果，分別配制體積分?jǐn)?shù)為5%、10%、15%、20%、25%的乙酸乙酯石油醚溶液作為洗脫劑，對(duì)吸附于硅膠柱上茄尼醇粗提物進(jìn)行洗脫試驗(yàn)，洗脫流速控制在4 mL/min（混合物上樣量約2 g）。結(jié)果表明，10%的乙酸乙酯石油醚溶液，即石油醚∶乙酸乙酯為9∶1的洗脫劑對(duì)茄尼醇的分離效果最好。在此條件下層析分離得到的茄尼醇經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)知其純度為81%，產(chǎn)率0.4%。

2.4.3 茄尼醇的精制 通過(guò)對(duì)幾種常見(jiàn)溶劑乙醇、丙酮、乙酸乙酯、石油醚的篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10倍體積的乙醇在-15 ℃的條件下對(duì)層析純化后的茄尼醇的結(jié)晶效果最好，收率達(dá)到86%，純度達(dá)到90%以上。圖2為標(biāo)準(zhǔn)樣、皂化后以及結(jié)晶精制后的茄尼醇高效液相色譜圖，圖中保留時(shí)間為8.5 min左右處峰即為茄尼醇峰，由圖2可以看出，結(jié)晶精制后茄尼醇的純度已達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)樣純度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了低次煙葉中茄尼醇的超聲波輔助提取方法和純化方法。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)以石油醚作為超聲波萃取低次煙草中茄尼醇的溶劑最為合適。由正交試驗(yàn)得出超聲波輔助提取低次煙葉中茄尼醇的工藝優(yōu)化條件為溫度50 ℃，時(shí)間60 min，料液比1∶15，超聲波功率200 W，在此條件下，茄尼醇提取率達(dá)到0.66%。茄尼醇粗提物經(jīng)過(guò)皂化反應(yīng)含量提高了約18%，皂化后產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱層析進(jìn)行分離，硅膠100～200目，洗脫劑為石油醚∶乙酸乙酯為 9∶1，茄尼醇產(chǎn)率0.4%，純度81%。此純度的茄尼醇繼續(xù)用10倍體積的乙醇在-15 ℃的條件下重結(jié)晶精制，純度達(dá)到90%，收率86%。

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