任建琳??呂祥??陳文婷??劉靜??侯風(fēng)剛

[摘要] 目的 研究中藥健脾復(fù)方通過Wnt/β-catenin信號通路抑制裸鼠人大腸癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制。 方法 建立人腸癌HT29細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為5組：模型組（生理鹽水組），健脾復(fù)方低、中、高劑量組[0.25，0.5，1mL/d]和5氟尿嘧啶組[1mg/（kg·2d）]。給藥第21天，各組均處死荷瘤鼠，測量腫瘤質(zhì)量。采用免疫組化法檢測各組瘤體的β-catenin表達(dá)。Elisa檢測裸鼠血清MMP-7表達(dá)。 結(jié)果 健脾復(fù)方低、中、高劑量組的瘤重抑制率分別為23.49%、45.64%、65.77%。免疫組化結(jié)果顯示，健脾復(fù)方能夠以劑量依賴性方式下調(diào)腫瘤組織β-catenin蛋白表達(dá)。Elisa結(jié)果顯示，健脾復(fù)方低、中、高劑量組裸鼠血清MMP-7表達(dá)量分別是模型組的0.84、0.62和0.45倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論 健脾復(fù)方能抑制人結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤的轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是通過Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)MMP-7表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 健脾復(fù)方；結(jié)腸癌；轉(zhuǎn)移；MMP-7；Wnt/β-catenin

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號] 2095-0616（2014）04-23-04

Jianpi complex prescription inhibits colorectal cancer metastasis in nude mice through Wnt/β-catenin signal transduction pathway

REN Jianlin LV Xiang CHEN Wenting LIU Jing HOU Fenggang

Shanghai Municipal TCM Hospital Affiliated to Shanghai University of Chinese Medicine，Shanghai 200071，China

[Abstract] Objective To study effects of Jianpi Complex Prescription to hypodermatic transplanted tumor metastasis in colorectal cancer nude mice. Methods Colorectal cancer models in nude mice bear human HT-29 cells were established，and then were randomLy divided into 5 groups： Control group （NS control group），Jianpi Complex Prescription low-dose，mid-dose，high-dose group （0.25，0.5，1mL/d），5-FU group （1 mg/kg·2d）.All group of nude mice were sacrificed at the last time treatment for 21 days，the size and weight of tumor were measured.The β-catenin was tested by Immunohistochemistry； the MMP-7 expression in mice serum was assayed by ELISA. Results The inhibition rate of tumor in each group were respectively 23.49%，45.64%，65.77% in low，mid，and high-dose Jianpi Complex Prescription.Jianpi Jiedu Recipe dose-dependently reduced the level of β-catenin in mice tumor.The MMP-7 in low，mid，high-dose Jianpi Jiedu Recipe was obviously decreased compared with Control group（P<0.01）. Conclusion Jianpi Complex Prescription could inhibited the metastasis of colon carcinoma implant tumor of nude mice， which may be due to blocking Wnt/β-catenin signal pathway and reducing MMP-7 expression.

[Key Words] Jianpi compoiund recipe；Colorectal cancer；Metastasis；MMP-7；Wnt/β-catenin

大腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)發(fā)病率居第3位[1-2]。目前大腸癌是以手術(shù)為主的綜合治療，中醫(yī)藥已成為結(jié)直腸癌綜合治療的重要方法[3-4]。我們以往的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明健脾法在大腸癌治療中有著重要的地位。本研究是在前期研究發(fā)現(xiàn)健脾復(fù)方能夠抑制裸鼠人腸癌轉(zhuǎn)移

的基礎(chǔ)上[5-6]，進(jìn)一步探討健脾復(fù)方通過Wnt/β-catenin信號通路抑制腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞系購自中科院上海細(xì)胞研究所。

1.2 動(dòng)物

BALB/c裸小鼠，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量（18±2）g，SPF級，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號SCXK（滬）2008-0016。endprint

1.3 藥物

健脾復(fù)方組成黃芪、黨參、炒白術(shù)、茯苓、炙甘草、半夏、虎杖、天龍、紅藤、藤梨根、生牡蠣，每毫升含生藥3g，由上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑室制備[5]；5氟尿嘧啶（5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批號20100910）；兔抗人β-catenin單克隆抗體（美國CST公司）；MMP-7 ELISA試劑盒（上海博谷生物科技有限公司）。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱（GalaxyS，英國RS Biotech公司）；熒光倒置顯微鏡（CKX41/U-RFLT50，日本OLYMPUS公司）；高速冷凍離心機(jī)（5804R，德國Eppendorf公司）；切片機(jī)（RM2145，德國Leico公司）。

1.5 方法

1.5.1 人腸癌細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞，用含10%的胎牛血清、1.5g/L碳酸氫鈉、1.5mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5.2 裸鼠人腸癌皮下移植瘤模型的建立及分組給藥 按照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法建立人腸癌HT-29細(xì)胞皮下移植瘤模型[7]。待腫瘤生長至100～300mm3，將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組10只：（1） 模型組（生理鹽水組）；（2） 健脾復(fù)方（0.25mL/d）；（3）健脾復(fù)方（0.5mL/d）；（4）健脾復(fù)方（1mL/d）；（5）5-FU[1mg/（kg·2d）]。健脾復(fù)方每天灌胃給藥，5-FU隔天腹腔注射給藥，模型組每天灌胃等量的生理鹽水。給藥第21天摘除眼球取血，處死小鼠，并取出瘤體，測量瘤體質(zhì)量。瘤重抑制率=（l-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%[8]。

1.6 免疫組化染色方法檢測β-catenin蛋白的表達(dá)

按照文獻(xiàn)中報(bào)道的方法[9]，將腫瘤組織以福爾馬林固定，石蠟包埋，切片。采用鏈霉素抗生素蛋白-過氧化酶（S-P）免疫組化染色法檢測腫瘤β-catenin蛋白的表達(dá)情況。每批染色均用已知的陽性切片做陽性對照，用PBS代替一抗做陰性對照。在Olympus IX71顯微鏡下觀察，陽性產(chǎn)物為棕黃色或棕褐色，背景為藍(lán)紫色。隨機(jī)選10個(gè)高倍視野（×200），細(xì)胞數(shù)大于1000個(gè)以上，陽性計(jì)數(shù)采用雙盲法，以陽性率作為觀察指標(biāo)。陽性表達(dá)率=表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 ELISA法檢測裸鼠血清中MMP-7表達(dá)

將裸鼠進(jìn)行摘除眼球取血，離心得到血清后進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，測定血清中MMP-7的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)步驟按參照博谷公司提供的試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 健脾復(fù)方對裸鼠人腸癌的生長抑制作用

模型組、健脾復(fù)方低、中、高劑量組（0.25，0.5，1mL/d）和5-FU組瘤體質(zhì)量分別為（1.49±0.19）g、（1.14±0.21）g、（0.81±0.19）g、（0.51±0.18）g和（0.43±0.15）g。健脾復(fù)方低、中、高劑量組瘤重抑制率為23.49%、45.64%、65.77%。與模型組比較，健脾復(fù)方能夠明顯抑制腫瘤的生長，呈劑量依賴性（P<0.01）。健脾復(fù)方高劑量組與5-FU組比較腫瘤移植瘤無顯著性差異。說明健脾復(fù)方能夠抑制裸鼠皮下移植瘤的生長。

2.2 健脾復(fù)方對裸鼠人腸癌β-catenin蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，健脾復(fù)方低、中、高劑量均能夠顯著下調(diào)瘤體中β-catenin蛋白表達(dá)（P<0.01），分別是對照組的0.80、0.61和0.37倍，呈劑量依賴性（圖1）。說明，健脾復(fù)方能夠下調(diào)瘤體中β-catenin蛋白表達(dá)水平。

2.3 健脾復(fù)方對裸鼠人腸癌血清MMP-7表達(dá)的影響

Elisa結(jié)果顯示，健脾復(fù)方低、中、高劑量組均能下調(diào)裸鼠血清中MMP-7表達(dá)水平（P<0.01），分別是對照組的0.84、0.62和0.45倍，呈劑量依賴性（圖1）。這表明，健脾復(fù)方能夠抑制裸鼠人結(jié)腸癌MMP-7表達(dá)。

3 討論

大腸癌屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”“腸風(fēng)”等范疇，現(xiàn)代醫(yī)家參合前人認(rèn)識(shí)和現(xiàn)代的臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為素體正氣虧虛，加之平素飲食不節(jié)（潔），脾胃虧虛，濕熱毒、瘀毒郁積，最終形成大腸癌。病位在腸，病本在脾，以本虛標(biāo)實(shí)為特點(diǎn)。本虛為脾虛，標(biāo)實(shí)為濕熱瘀毒聚結(jié)。目前大腸癌的中醫(yī)辨證分型尚不統(tǒng)一，但綜合國內(nèi)的研究報(bào)道，脾虛是臨床上大腸癌的常見的中醫(yī)證型[10-11]。脾虛證貫穿于大腸癌的始終，并在大腸癌發(fā)生和轉(zhuǎn)移中具有重要作用。因此，健脾法在大腸癌治療中有著重要的地位。

健脾復(fù)方以黃芪為君，合四君子湯健脾益氣，以資后天之本，脾氣得健，則氣生血運(yùn)，正氣得復(fù)；佐以半夏、天龍、紅藤、藤梨根、生牡蠣等解毒散結(jié)之品，使腫塊得以徐徐消之，全方寓攻于補(bǔ)，攻補(bǔ)兼施，共奏扶正祛邪之功。健脾復(fù)方長期應(yīng)用于大腸癌的治療，能夠明顯改善大腸癌患者臨床癥狀，減輕化療的不良反應(yīng)，有效提高術(shù)后患者5年的生存率和降低1、2年轉(zhuǎn)移率[12-13]。實(shí)驗(yàn)研究表明，健脾復(fù)方能夠抑制人大腸癌裸鼠移植瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腸癌的肝轉(zhuǎn)移[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，健脾復(fù)方能夠以劑量依賴性方式抑制人腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Wnt/β-catenin信號通路與大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。作為Wnt/β-catenin信號通路的核心基因，β-catenin降解復(fù)合體的異常（如APC或axin突變等）和β-catenin基因本身的突變均可致β-catenin降解障礙，在胞質(zhì)內(nèi)積累繼而進(jìn)入細(xì)胞核，激活轉(zhuǎn)錄因子Tcf-4/LEF，啟動(dòng)靶基因VEGF、MMP-7等轉(zhuǎn)錄[17-19]，從而促進(jìn)大腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。為了研究健脾復(fù)方是否對腸癌Wnt/β-catenin信號通路有影響，我們采用免疫組化檢測該信號通過關(guān)鍵分子β-catenin蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，健脾復(fù)方能夠下調(diào)β-catenin表達(dá)水平，呈劑量依賴性。腫瘤在侵襲轉(zhuǎn)移過程中，細(xì)胞外基質(zhì)ECM的破壞是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在參與破壞ECM的酶類中MMPS是最重要的水解酶，尤其是MMP-7[19]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，健脾復(fù)方能夠下調(diào)MMP-7表達(dá)。由于MMP-7是Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控的靶基因，因此我們推測健脾復(fù)方可能是通過Wnt/β-catenin信號通路抑制MMP-7表達(dá)來抑制腸癌的轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果與厚樸酚通過Wnt/β-catenin信號通路下調(diào)MMP-7表達(dá)[20]，從而抑制人腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的觀點(diǎn)一致。endprint

綜上所述，健脾復(fù)方能夠抑制人腸癌裸鼠皮下移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路而發(fā)揮作用，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2013-11-24）endprint