秦俊哲， 任金玫， 殷 紅

0 引言

桑黃(Phellinuslinteus),擔(dān)子菌亞門多孔菌科針層孔菌屬真菌，是一種珍貴的藥用真菌[1]，最早記載于李時(shí)珍《本草綱目》，而桑黃多糖為桑黃的

主要功效成分[2]，其藥理作用主要有抗癌、增強(qiáng)免疫力[3]、抗纖維化[4]、降血糖[5]等.目前有很多關(guān)于桑黃多糖的提取工藝的研究報(bào)道，但有關(guān)微波輔助提取桑黃子實(shí)體多糖的工藝研究，鮮有報(bào)道.微波輔助提取技術(shù)是近年來新發(fā)展起來的一種方法，相比于傳統(tǒng)的提取方法，具有提取效率高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)[6]，現(xiàn)已成功應(yīng)用于天然植物活性成分的提取[7].本實(shí)驗(yàn)將微波輔助提取法應(yīng)用桑黃子實(shí)體多糖的提取工藝研究，采用響應(yīng)曲面法(Response Surface Methodology)對微波輔助提取桑黃多糖的工藝進(jìn)行初步探索并優(yōu)化，為桑黃子實(shí)體多糖的提取提供一定的參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 原料

桑黃子實(shí)體，陜西科技大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室人工培育.

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、苯酚、DNS試劑、濃硫酸、無水乙醇、95%乙醇、丙酮和乙醚，均為分析純.

1.1.3 主要儀器

WD900(MG-5562S)格蘭仕微波爐；TGL-16M高速臺式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；756PC紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海榮生有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司.

1.2 方法

1.2.1 桑黃多糖的提取工藝流程

桑黃子實(shí)體→粉碎→80%乙醇回流→烘干濾渣→粉碎→過篩→微波提取→抽濾→濃縮→4倍體積醇沉→離心→洗滌→定容→粗多糖溶液.

1.2.2 多糖含量的測定與計(jì)算

采用苯酚-硫酸法測定水溶性總糖質(zhì)量,采用DNS法測定還原糖質(zhì)量[8].

多糖質(zhì)量及其得率的計(jì)算公式如下[9]：

多糖質(zhì)量(g)=總糖質(zhì)量(g)-還原糖質(zhì)量(g)

多糖得率(%)=[多糖質(zhì)量(g)/原料質(zhì)量(g)]×100%

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

影響桑黃多糖得率的因素有很多，現(xiàn)通過單因素實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)因素與水平.

1.2.4 微波輔助提取桑黃多糖的工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[10]，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對微波輔助提取桑黃多糖較顯著的因素，即提取時(shí)間、微波功率、料液比，分別用A、B、C表示，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示.

表1 Box-Behnken因子水平編碼表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對桑黃多糖得率的影響

稱取4份桑黃粉末各1 g，選定料液比分別為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，在微波功率為540 W的條件下提取5 min，結(jié)果如圖1所示.

圖1 料液比對多糖得率的影響

由圖1可知，多糖得率隨著料液比的增加而增大，但增加到1∶40時(shí)趨于平穩(wěn)，因此選擇料液比為1∶40左右較適宜.

2.1.2 提取時(shí)間對桑黃多糖得率的影響

固定料液比為1∶40，在微波功率為540 W的條件下，考察不同提取時(shí)間對多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 提取時(shí)間對多糖得率的影響

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，多糖得率不斷增加.4 min之前增加較為明顯，5 min之后有下降趨勢.可能是因?yàn)闀r(shí)間過長，會(huì)破壞部分多糖的結(jié)構(gòu)，因此選擇提取時(shí)間為5 min左右.

2.1.3 微波功率對桑黃多糖得率的影響

固定料液比為1∶40，在微波功率180 W、360 W、540 W、720 W條件下處理5 min，結(jié)果如圖3所示.

圖3 微波功率對多糖得率的影響

從圖3中看出，多糖得率隨微波功率的增大而呈先升后降趨勢，微波功率540 W時(shí)多糖的含量達(dá)到最大，功率720 W時(shí)多糖含量有降低的趨勢；這可能是因?yàn)楣β势蜁r(shí)浸提不完全，而功率過大時(shí)會(huì)破壞多糖的結(jié)構(gòu)，故選取微波功率540 W左右較適宜.

2.1.4 提取次數(shù)對桑黃多糖得率的影響

固定料液比為1∶40，在微波功率為540 W時(shí)提取5 min，比較不同提取次數(shù)對桑黃多糖得率的影響，結(jié)果如圖4所示.

圖4 提取次數(shù)對多糖得率的影響

由圖4知，浸提第2次比第1次的多糖得率增加顯著，而浸提3次多糖得率增加很少，從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選擇2次提取為宜.

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

以桑黃多糖得率為響應(yīng)值(y)，分別以-1、0、1代表自變量的低、中、高水平，設(shè)計(jì)3因素3水平實(shí)驗(yàn)，其中1-12是析因?qū)嶒?yàn)，13-17是中心實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果如表2所示.

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 模型的建立與顯著性檢驗(yàn)

利用Design-Expert 8.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到桑黃多糖得率對以上3個(gè)變量的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=4.24+0.016A+0.093B+0.021

C-0.093AB-0.15AC-0.048BC-

0.17A2-0.35B2-0.15C2

回歸模型方差分析如表3所示.

表3 回歸模型方差分析表

表4 回歸方程系數(shù)顯著性分析

注：“***” 差異極顯著(p<0.001)；“**”差異高度顯著(p<0.01).

由表4知，微波功率的一次項(xiàng)達(dá)到高度顯著水平(P<0.01)，對多糖產(chǎn)率的影響最大，其次是提取時(shí)間與料液比.另外，提取時(shí)間與微波功率的交互作用達(dá)到高度顯著水平，時(shí)間與料液比的交互作用差異極顯著；考察二次項(xiàng)可知，微波功率二次項(xiàng)>時(shí)間二次項(xiàng)>料液比二次項(xiàng)，且均達(dá)到極顯著水平.

2.2.3 響應(yīng)面分析

圖5 Y=f(A，B)的響應(yīng)面與等高線圖

圖6 Y=f(A，C)的響應(yīng)面與等高線圖

借助Design Expert 8.0軟件，根據(jù)回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面和等高線圖.從等高線中可以直觀判斷兩因素交互作用情況，圓形表示二因交互作用不顯著，橢圓表示二因素交互作用顯著[11].本實(shí)驗(yàn)中3個(gè)因素之間交互作用對多糖得率的影響如圖5和圖6所示.從這兩組圖的響應(yīng)面最高點(diǎn)和等高線可以看出，在所選范圍內(nèi)存在極值.由圖5可以得知，液料比為40∶1時(shí)，隨著提取時(shí)間在4.5～5.5 min之間變化，多糖得率增加并不明顯，當(dāng)微波功率從360 W增加到720 W時(shí)，多糖得率呈先增大后降低的趨勢，因此適當(dāng)提高微波功率可以提高多糖得率.

從圖6可以看出，當(dāng)微波功率為540 W時(shí)，隨著時(shí)間和料液比的增大，桑黃多糖的得率達(dá)到最大值，當(dāng)時(shí)間和料液比繼續(xù)增大時(shí)，多糖得率降低.

2.2.4 提取工藝條件的確定

通過回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，微波輔助提取桑黃多糖的最佳工藝參數(shù)為：提取時(shí)間5.1 min，微波功率558 W，料液比為1∶41，在此工藝條件下，桑黃多糖得率的理論值為4.241%.為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取桑黃多糖工藝的可靠性，采用已優(yōu)化到的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，由于實(shí)際操作條件有限，將工藝參數(shù)調(diào)整為：提取時(shí)間5.1 min，微波功率540 W，料液比1∶41，提取2次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，測得多糖得率為4.18%，與理論預(yù)測值相比，相對誤差在1.4%左右.

因此，基于響應(yīng)面法優(yōu)化得到的微波輔助提取工藝參數(shù)，準(zhǔn)確可靠.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取桑黃多糖的工藝條件，并確定最佳的提取工藝參數(shù)為：提取時(shí)間5.1 min，微波功率540 W，料液比1∶41，提取次數(shù)為2次，在此條件下，多糖得率可達(dá)4.18%.

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