張小娜等

[摘要] 目的 研究茯磚茶不同溶劑提取物體外抗氧化活性，并測(cè)定其總多酚、黃酮含量。 方法 以抗壞血酸為陽性對(duì)照，采用二苯代苦味?；―PPH）、[2，2'-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽]（ABTS）及鐵離子還原/抗氧化能力（FRAP）三種抗氧化模型，評(píng)價(jià)茯磚茶80%乙醇（總提物）、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水5種不同溶劑提取物體外清除DPPH、ABTS+自由基能力和對(duì)鐵離子的還原/抗氧化能力。 結(jié)果 茯磚茶乙酸乙酯提取物總多酚含量最高，正丁醇提取物黃酮含量最高，分別為（291.38±5.24）、（222.86±6.12）mg/g。茯磚茶不同溶劑提取物均具有一定的抗氧化活性，清除ABTS+自由基和鐵離子還原/抗氧化能力為：總提物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物；清除DPPH自由基的能力為：乙酸乙酯提取物>總提物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。茯磚茶總提物和乙酸乙酯提取物均具有良好的抗氧化活性，清除DPPH自由基能力的半清除率濃度（IC50）分別為0.048、0.043 g/L，清除ABTS+自由基能力的IC50分別為0.025、0.027 g/L。茯磚茶抗氧化能力與總多酚含量呈正相關(guān)。 結(jié)論 茯磚茶提取物具有良好的抗氧化能力，為開發(fā)功能性抗氧化劑提供科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 茯磚茶；抗氧化活性；二苯代苦味?；杂苫鶞y(cè)定法；[2，2'-連氨-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽]自由基測(cè)定法；鐵離子還原/抗氧化能力法

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2014）04（a）-0009-05

Antioxidant activities of different extracts from Fuzhuan Brick Tea

ZHANG Xiaona1，2 ZOU Xianwei2，3 LI Ying1，2 ZHENG Saijing3 WANG Weimiao3 WANG Ying1，2 TANG Jintian1，2 ZHANG Yangde1，4

1.School of Chinese Materia Medical， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China； 2.Education Ministry Key Laboratory of Technology and Radiation Imaging， Department of Engineering Physics of Tsinghua University， Beijing 100084， China； 3.Key Laboratory of Cigarette Smoke in Tobacco Industry， Shanghai Tobacco Group Corporation， Shanghai 200082， China； 4.Hepatobiliary and Enteric Surgery Research Center of National Health and Family Planning Commission， Central South University， Hu′nan Province， Changsha 410008， China

[Abstract] Objective To study the in vitro antioxidant activities of different extracts from Fuzhuan Brick Tea and determine the total phenolics and flavonoid contents of them. Methods The antioxidant activities of its total extract （80% ethanol）， petroleum ether， ethyl acetate， n-butanol， water extracts were evaluated by several in vitro experiments including DPPH assay， ABTS assay and FRAP assay with ascorbic acid as a positive control. Results The ethyl acetate extract had the highest amount of total phenolics [（291.38±5.24） mg gallic acid equivalents/g] and the n-butanol extract had the highest amount of flavonoid [（222.86±6.12） mg rutin equivalents/g）]. The different extracts from Fuzhuan Brick Tea all showed certain antioxidant capacity. The capacities of scavenging ABTS+ radicals and reducing iron were as follow： total extract > ethyl acetate > n-butanol extract >water extract> petroleum ether extract， the capacity of scavenging DPPH radicals was： ethyl acetate extract > total extract > n-butanol extract >water extract> petroleum ether extract. The total extract and ethyl acetate extract from Fuzhuan Brick Tea showed significant antioxidant activities. The total extract displayed significant capacity of scavenging DPPH and ABTS+ radicals， with IC50 values of 0.048 and 0.025 g/L， respectively. The ethyl acetate extract exhibited in vitro activity against above-mentioned two radicals， with IC50 values of 0.043 and 0.027 g/L. There was a positive correlation between the total phenolics and the antioxidant capability of them. Conclusion Different extracts from Fuzhuan Brick Tea shows strong antioxidant activities， which can be used as a potential source of natural antioxidants in food industry.

[Key words] Fuzhuan Brick Tea； Antioxidant activity； DPPH assay； ABTS assay； FRAP assay

茯磚茶屬于黑茶的一種，約在公元1368年問世，是我國(guó)邊疆少數(shù)民族的必需品。茯磚茶含有茶多酚、咖啡堿、氨基酸、多糖、微量元素等化學(xué)成分[1]，具有抑菌[2-4]、降脂減肥[5-6]、降血糖[7]、抗腫瘤[8]等保健功效。此外，茯磚茶還具有清除自由基[9]、保護(hù)細(xì)胞氧化受損活性[10]作用，但目前只有湖南茯磚茶水提物抗氧化活性的零星報(bào)道，不夠系統(tǒng)全面，且茯磚茶不同極性溶劑提取物活性成分與抗氧化活性的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究對(duì)茯磚茶不同溶劑提取物的總多酚和黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，并通過測(cè)定它們對(duì)DPPH和ABTS+自由基的清除能力及對(duì)Fe3+的還原能力，綜合評(píng)價(jià)其抗氧化作用，為茯磚茶作為一種天然抗氧化劑的推廣利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

恒溫金屬加熱器（金銀杏生物科技（北京）有限公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-RAD公司，BIO-RAD型），F(xiàn)W100型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），KQ 5200 DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），EYEL4旋蒸儀（日本EYELA公司），DZF-6050型真空干燥箱（北京神泰偉業(yè)儀器設(shè)備有限公司），AL204-IC型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，SHZ-CB型循環(huán)水式真空泵（鞏義市英峪予華儀器廠），微量移液器（美國(guó)Thermo公司），NANOpure超純水系統(tǒng)（美國(guó)Barnstead公司），96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔板（美國(guó)Corning公司）。

1.2 樣品與試劑

茯磚茶（一品茯茶，湖南益陽茶廠）；2，2′-連氨-（ 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨鹽（ABTS，Amresco公司）；二苯代苦味?；―PPH，Alfa Aesar公司）；抗壞血酸（廣州化學(xué)試劑廠）；沒食子酸（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；福林酚（Sigma公司）；蘆丁（成都曼思特生物科技公司）；氯化鋁（天津福晨化學(xué)試劑廠）常規(guī)溶劑；乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等均為北京化工廠分析產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品溶液的提取和制備

將3.27 kg茯磚茶粉碎，80%乙醇浸泡提取3次，分別為72，48，48 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮干燥得總提取物230 g；將總提取物加水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇溶劑進(jìn)行萃取，濃縮干燥，得石油醚提取物1.75 g，乙酸乙酯提取物64 g，正丁醇提取物82 g，水提取物38 g的不同溶劑提取物。取各不同溶劑提取物10 mg，用不同溶劑定容至10 mL（總提取物用超純水，其余用無水乙醇），得1.0 g/L母液10 mL，分別用相應(yīng)溶劑稀釋，得到0.01，0.0125，0.02，0.025， 0.04，0.05 g/L的供試溶液。

2.2 總多酚、黃酮含量測(cè)定

2.2.1 總多酚含量測(cè)定

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考文獻(xiàn)[11]，采用Folin-Ciocalteu比色法，稍作修改。吸取質(zhì)量濃度分別為0.01～0.10 g/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL于96孔板中，加入10%福林酚水溶液100 μL，混勻，反應(yīng)5 min，加入7.5%碳酸鈉溶液80 μL，混勻，室溫反應(yīng)1 h，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=2.1277X- 0.0084，r2=0.999。

2.2.1.2 樣品總多酚含量測(cè)定 將不同溶劑提取物樣品母液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，按照上述方法顯色，測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中總多酚含量，結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量（mg/g）。

2.2.2 黃酮含量測(cè)定

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 參考文獻(xiàn)[12]，采用AlCl3顯色法，稍作修改。吸取質(zhì)量濃度分別為0.01～0.10 g/L的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL于96孔板中，加入100 μL 0.1 mol/L AlCl3和50 μL醋酸-醋酸鈉的緩沖液（pH 5.2），搖勻，40℃反應(yīng)15 min，在400 nm處測(cè)定吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=1.8861X-0.0087，r2=0.999。

2.2.2.2 樣品黃酮含量測(cè)定 將不同溶劑提取物樣品母液稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，按照上述方法測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中黃酮含量，結(jié)果表示為蘆丁當(dāng)量（mg/g）。

2.3 抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 清除DPPH自由基能力的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[13]的方法，略有改進(jìn)。配制DPPH自由基測(cè)定液：稱取7.88 mg DPPH自由基，用無水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成2×10-3 mol/L的DPPH自由基溶液，于0～4℃避光保存，備用。測(cè)定：分別移取質(zhì)量濃度為0.01，0.0125，0.02，0.025，0.04， 0.05 g/L的各不同溶劑提取物供試溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL DPPH自由基測(cè)定液，迅速混勻，37℃恒溫反應(yīng)30 min后，在510 nm處測(cè)定吸光度。陰性對(duì)照以相應(yīng)溶劑代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。所有的測(cè)量值均做3個(gè)復(fù)孔取其平均值。VC作為陽性對(duì)照。樣品的抗氧化程度用對(duì)DPPH自由基的清除率表示，清除率越大，抗氧化活性越強(qiáng)，反之則弱。計(jì)算公式如下：

清除率=（1-A1/A0）×100%

（A0為陰性對(duì)照組吸光度；A1為樣品組吸光度）。

2.3.2 清除ABTS+自由基能力的測(cè)定

參考文獻(xiàn)[14]和文獻(xiàn)[15]的方法，并作適當(dāng)修改。配制ABTS+自由基儲(chǔ)備液：配制2.45 mmol/L K2S2O8溶液和7.0 mmol/L ABTS溶液，二者等體積混合，避光條件下靜置16 h，形成ABTS+自由基儲(chǔ)備液。配制ABTS+自由基測(cè)定液：將ABTS+自由基儲(chǔ)備液用溶劑稀釋，使其吸光度在734 nm波長(zhǎng)處達(dá)到0.700±0.020。測(cè)定：移取質(zhì)量濃度為0.01， 0.0125，0.02，0.025，0.04， 0.05 g/L的各不同溶劑提取物供試溶液50 μL于96孔板中，加入150 μL ABTS+自由基測(cè)定液，混勻，室溫反應(yīng)30 min，在734 nm處測(cè)定吸光度。陰性對(duì)照以相應(yīng)溶劑代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。所有的測(cè)量值均做3個(gè)復(fù)孔取其平均值。VC作為陽性對(duì)照。樣品對(duì)ABTS+自由基的清除率照下面公式計(jì)算：

清除率=（1-A1/A0）×100%

（A0為陰性對(duì)照組吸光度；A1為樣品組吸光度）。

2.3.3 鐵離子的還原/抗氧化能力（FRAP法）

參照文獻(xiàn)[16]的方法，略做改進(jìn)。取質(zhì)量濃度為0.01，0.0125，0.02，0.025，0.04，0.05 g/L的各不同溶劑提取物供試溶液1.0 mL，加入1.0 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.6），1.0 mL K3Fe（CN）6。上述混合物于50℃恒溫20 min后，加入1.0 mL10%的三氯乙酸水溶液終止反應(yīng)，3000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL FeCl3，混勻，在700 nm處測(cè)定吸光度A。陰性對(duì)照以相應(yīng)溶劑代替樣品溶液，其余步驟與樣品相同。所有的測(cè)量值均做3個(gè)復(fù)孔取其平均值。VC作為陽性對(duì)照。

2.3.4 結(jié)果測(cè)定

半清除率濃度（IC50）計(jì)算根據(jù)回歸方程計(jì)算清除率為50%時(shí)的濃度（g/L）。

2.4 結(jié)果

2.4.1 總多酚、黃酮含量

茯磚茶不同溶劑提取物總多酚、黃酮含量見表1。不同溶劑提取物中總多酚含量在59.90～291.38 mg/g之間，其含量從高到低依次為乙酸乙酯提取物>總提物>正丁醇提取物>石油醚提取物>水提取物。提取物黃酮含量在83.24～222.86 mg/g之間，其含量從高到低依次為正丁醇提取物>總提物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物。

表1 不同溶劑提取物總多酚、黃酮含量（x±s）

2.4.2 清除DPPH自由基的作用

清除DPPH自由基能力的測(cè)定結(jié)果及IC50，分別見圖1和表2。從圖1中可以看出，茯磚茶不同溶劑提取物對(duì)DPPH自由基均有清除作用，并且在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。各溶劑提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛∥?gt;總提物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。乙酸乙酯提取物、總提物的IC50分別為0.043、0.048 g/L，略弱于陽性對(duì)照抗壞血酸（0.031 g/L），表明茯磚茶總提物及乙酸乙酯提取物具有良好的抗氧化能力。

圖1 不同溶劑提取物清除DPPH自由基作用

2.4.3 清除ABTS+自由基作用

ABTS法清除自由基能力的測(cè)定結(jié)果及半清除率濃度，分別見圖2和表2。茯磚茶不同溶劑提取物對(duì)ABTS+自由基都表現(xiàn)出一定程度的清除能力，并在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。不同溶劑提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力順序?yàn)椋嚎偺嵛?gt;乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提物>石油醚提取物。乙酸乙酯提取物、總提物的清除ABTS+自由基的IC50分別為0.027、0.025 g/L，略低于陽性對(duì)照抗壞血酸（0.017 g/L），表明茯磚茶總提物及乙酸乙酯提取物具有良好的抗氧化能力。

圖2 不同溶劑提取物清除ABTS+自由基作用

2.4.4 鐵離子的還原/抗氧化能力

從圖3中可以看出，石油醚提取物鐵還原能力較弱。其他溶劑提取物隨著濃度增加，吸光度逐漸增大，表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樣品濃度越高，還原能力越強(qiáng)。不同溶劑提取物鐵離子還原能力的順序?yàn)椋嚎偺嵛?gt;乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>水提取物>石油醚提取物。

圖3 不同溶劑提取物鐵離子還原能力

2.4.5 總多酚、黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性

茯磚茶不同溶劑提取物清除DPPH、ABTS+自由基的能力與總多酚含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.9294、0.8845，相關(guān)性良好。而黃酮含量與DPPH、ABTS+自由基清除能力以及還原力的相關(guān)系數(shù)分別為0.1818、0.3031和0.2694，相關(guān)性較差。分析表明總多酚含量與抗氧化活性呈正相關(guān)，推測(cè)酚類物質(zhì)是茯磚茶提取物清除自由基及抗氧化的主要成分。

3 討論

自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類可以單獨(dú)存在的具有高度氧化活性的帶有一個(gè)或幾個(gè)不配對(duì)電子的分子或原子，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)活躍[17]，對(duì)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子發(fā)生破壞性反應(yīng)，損害機(jī)體的組織和細(xì)胞，進(jìn)而引起各種病變[18-19]?，F(xiàn)已明確許多疾病或癥狀，如心臟病、老年癡呆癥、帕金森病和腫瘤等都與自由基有關(guān)[20]。植物中多酚[21]、黃酮[22]等活性物質(zhì)能夠清除過剩的自由基，具有一定的抗氧化活性。

本文采用FRAP法、DPPH法和ABTS法對(duì)茯磚茶不同溶劑提取物進(jìn)行了抗氧化活性研究，比較了茯磚茶不同溶劑提取物對(duì)鐵的還原抗氧化能力和對(duì)DPPH及ABTS+兩種自由基的清除能力，并測(cè)定了茯磚茶不同溶劑提取物中總多酚和黃酮的含量。結(jié)果表明，茯磚茶不同溶劑提取物均具有清除自由基、抑制鐵氧化的能力，其中總提物清除ABTS+自由基（IC50為0.025 g/L）及還原Fe3+的能力最強(qiáng)，乙酸乙酯提取物清除ABTS+自由基（IC50為0.027 g/L）及還原Fe3+的能力次之，石油醚提取物清除ABTS+自由基（IC50為0.556 g/L）及還原Fe3+的能力最弱。清除DPPH自由基方面，乙酸乙酯提取物清除能力最強(qiáng)（IC50為0.043 g/L），總提物清除能力次之（IC50為0.048 g/L），石油醚提取物清除能力最弱（IC50為0.456 g/L）。而茯磚茶不同極性提取物總多酚、黃酮含量測(cè)定表明：茯磚茶不同極性部位均能提取出一定量的總多酚和黃酮，其中以乙酸乙酯和正丁醇提取物含量較多。分析茯磚茶不同溶劑提取物抗氧化能力與總多酚黃酮含量的關(guān)系，結(jié)果表明隨著總多酚含量提高，抗氧化活性提高，說明了抗氧化活性與其所含的多酚有一定關(guān)系。

通過茯磚茶不同溶劑提取物的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，表明茯磚茶具有良好的抗氧化活性，為進(jìn)一步利用茯磚茶活性成分作為天然抗氧化劑用于食品工業(yè)及卷煙過濾煙嘴等提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2013-10-03 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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（收稿日期：2013-10-03 本文編輯：衛(wèi) 軻）

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（收稿日期：2013-10-03 本文編輯：衛(wèi) 軻）