林景衛(wèi)，賈佳，鐘鳴，陳麗靜，李浩戈，郭志富，齊明芳，劉立俠，李天來

農(nóng)業(yè)生物技術(shù)

金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因fip-fve在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)型和組成型表達

林景衛(wèi)1,2，賈佳2，鐘鳴2，陳麗靜2，李浩戈2，郭志富2，齊明芳1，劉立俠3，李天來1

1 沈陽農(nóng)業(yè)大學園藝學院，遼寧 沈陽 110866
2 沈陽農(nóng)業(yè)大學生物科學技術(shù)學院，遼寧 沈陽 110866
3 東北師范大學生命科學學院，吉林 長春 130024

為獲得穩(wěn)定來源并且具有生物學活性的重組金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fip-fve)，將fip-fve基因轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115中進行誘導(dǎo)型和組成型表達。用PCR方法從金針菇子實體基因組DNA中擴增fip-fve基因，連接至pPIC9構(gòu)建誘導(dǎo)型表達載體pPIC9-FIP-fve，從畢赤酵母基因組DNA中擴增三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子(pgap)，替換pPIC9-FIP-fve上乙醇氧化酶啟動子 (paox1) 構(gòu)建組成型表達載體pPIC9-PGAP-FIP-fve。將線性化的兩種表達載體用PEG法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)組氨酸缺失培養(yǎng)基篩選和酵母菌落PCR鑒定后進行表達。結(jié)果表明，重組Fip-fve在以甲醇 (1%，V/V) 為碳源進行誘導(dǎo)型表達4 d達到最高，粗蛋白表達量為158.2 mg/L，在以葡萄糖 (10%) 和甘油 (1%，V/V) 為碳源進行組成型分別在表達第4天和第5天達到最高，粗蛋白分別為46.3 mg/L和29.5 mg/L。SDS-PAGE及Western blotting證明重組Fip-fve已正確表達，血細胞凝集活性檢測初步證明重組Fip-fve具有良好生物學活性。

金針菇,免疫調(diào)節(jié)蛋白,畢赤酵母,組成型表達

金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fip-fve) 是上個世紀末從金針菇子實體中提純的一種小分子功能蛋白質(zhì)，隸屬于真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白 (Fip) 家族[1]。迄今為止，多種真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白已被發(fā)現(xiàn)，包括靈芝、松杉靈芝、草菇、黑芝和紫芝等[2-5]，該家族蛋白由110個左右氨基酸組成，分子量為12–13 kDa，具有免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。Fip-fve由114個氨基酸組成，分子量為12.7 kDa，與第一個已知的真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白——LZ-8具有63%的同源性[2]，天然的Fip-fve為類似啞鈴型的同源二聚體[6-7]，在酸性和高低溫條件下均能保持良好的生物學活性[8]。Fip-fve具有血細胞凝集活性，可以在體外凝集4種類型的人血細胞。Fip-fve還可以促進人外周血淋巴細胞增殖，并且明顯增加多種細胞因子分泌包括白介素2和干擾素γ[9]。Fip-fve具有良好的抗過敏活性，有研究表明其可以完全抑制由牛血清蛋白 (BSA) 引起的小鼠系統(tǒng)過敏反應(yīng)[1]，能夠抑制嗜酸性粒細胞引起的過敏性鼻炎[10]，F(xiàn)ip-fve還可以抑制卵清蛋白 (OVA) 引起的食物過敏反應(yīng)[11]和用來治療羽刺皮癬螨2型抗原 (Dp-2) 引起的呼吸道炎癥[12]。此外，F(xiàn)ip-fve還具有抗腫瘤活性[13]，Chang等發(fā)現(xiàn)給患有肝癌的小鼠口服喂食Fip-fve可以延長患病小鼠的存活期[14]，干擾素γ可能是起抗腫瘤活性的關(guān)鍵效應(yīng)分子[15-16]。

從天然金針菇子實體中提純Fip-fve過程繁瑣，費時費力，而且產(chǎn)率較低[5]，因此越來越多的研究學者嘗試利用基因工程的手段在不同的表達宿主中重組表達Fip-fve，以期望得到高效表達的重組蛋白。1997年，Lin等首先將fip-fve基因轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中，獲得了谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶融合的重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白，表達水平分別5 mg/L, 但是其生物學活性僅為天然Fip-fve的一半[17]。之后，他們又將該蛋白在昆蟲表達系統(tǒng)——Sf21細胞 (草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda) 中進行表達，重組Fip-fve具有類似天然蛋白的生物學活性，但是產(chǎn)量依然較低，為6.25 mg/L (3.1 μg/1×106cells)[18]。畢赤酵母表達系統(tǒng)是近些年來興起的一種外源蛋白表達系統(tǒng)，由于其兼有原核和真核表達系統(tǒng)的優(yōu)點，在基因工程領(lǐng)域中得到日益廣泛的應(yīng)用，考慮金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白的特點和其他表達系統(tǒng)的不足，本研究以畢赤酵母為宿主，進行fip-fve基因誘導(dǎo)型和組成型兩種重組表達，探究其在兩種模式下的重組表達效率并檢測重組Fip-fve的生物學活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與載體

大腸桿菌Excherichia coli TOP10感受態(tài)細胞和pGM-T載體購自北京天根生化有限公司；畢赤酵母Pichia pastoris GS115和表達載體pPIC9為本實驗室保存；金針菇Flammulina velutipes子實體購自當?shù)厥袌觥?/p>

1.1.2 酶和試劑

限制性內(nèi)切酶，DNA和蛋白質(zhì)標準分子量為大連TaKaRa產(chǎn)品；Taq DNA聚合酶和T4 DNA連接酶為北京天根生化有限公司產(chǎn)品；Sephadex G-100為美國GE產(chǎn)品；人血紅細胞由沈陽農(nóng)業(yè)大學校醫(yī)院志愿者提供；小鼠抗Fip-fve的多克隆抗體由天津天健生物制藥有限公司制備；預(yù)染標準分子量蛋白質(zhì)、PV膜、羊抗小鼠HRP-抗體和ECL熒光試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；酵母轉(zhuǎn)化試劑盒為美國ZYMO產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基、YPD、BMM和MD培養(yǎng)基參考畢赤酵母表達手冊[19]。畢赤酵母誘導(dǎo)型培養(yǎng)基改進為：YNB，6.7 g/L，酵母粉，0.1 g/L，蛋白胨，0.2 g/L。組成型培養(yǎng)基改進為：YNB，6.7 g/L，酵母粉，0.2 g/L，蛋白胨，0.4 g/L，葡萄糖/甘油，10%。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆

按照程度等的方法提取金針菇及酵母的基因組DNA[20]。根據(jù)已知的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因序列和酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列分別設(shè)計fip-fve及pgap的擴增引物 (表1)。上述引物均由上海生工生物公司合成。fip-fve的PCR程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，60 ℃1 min，72 ℃ 1 min，32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。pgap的PCR程序為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂條凝膠電泳，分別回收330 bp (fip-fve) 和 500 bp (pgap) 左右的片段，與pGM-T載體 (Amp+) 連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10，經(jīng)過藍白斑篩選和菌落PCR檢測，挑取陽性克隆送至上海生工生物公司測序。

表1 本研究所用相關(guān)引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 載體構(gòu)建

提取含有fip-fve的pGM-T質(zhì)粒DNA，與畢赤酵母表達載體pPIC9 (Amp+) 同時進行EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，瓊脂糖電泳，回收fip-fve和pPIC9片段，連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)Amp抗性篩選和菌落PCR檢測得到陽性克隆，獲得誘導(dǎo)型表達載體pPIC9-FIP-fve。提取含有PGAP的pGM-T質(zhì)粒DNA，與誘導(dǎo)型表達載體pPIC9-FIP-fve (Amp+) 同時進行SacⅠ和BamHⅠ雙酶切，瓊脂糖電泳，回收pgap和pPIC9-FIP-fve片段，連接，轉(zhuǎn)化，經(jīng)Amp抗性篩選和菌落PCR檢測得到陽性克隆，獲得組成型表達載體pPIC9-PGAP-FIP-fve。

1.2.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選

大量提取質(zhì)粒pPIC9-FIP-fve和pPIC9-PGAP-FIP-fve (≥5 μg)，用SacⅠ酶切，回收目的片段。酵母感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化參考酵母轉(zhuǎn)化試劑盒進行操作，將轉(zhuǎn)化后的酵母菌液涂布于不含氨基酸的MD固體平板上，30 ℃培養(yǎng)2–3 d，直至長出酵母轉(zhuǎn)化子。將不同酵母轉(zhuǎn)化子重新接種至新MD平板，編號，以fip-fve引物進行酵母菌落PCR檢測。

1.2.4 重組Fip-fve表達與檢測

挑取PCR陽性的酵母菌落進行重組表達，轉(zhuǎn)pPIC9-FIP-fve的進行誘導(dǎo)型重組表達，先將酵母接種YPD液體培養(yǎng) (200 mL/500 mL 三角搖瓶，共10瓶)，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16–18 h，離心收集菌體，再轉(zhuǎn)入甲醇誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基BMM (200 mL/500 mL 三角搖瓶，共2瓶) 中，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，每隔1天補加1%甲醇，同時取培養(yǎng)液離心收集上清。轉(zhuǎn)pPIC9-PGAP-FIP-fve的酵母進行組成型表達，將PCR陽性的酵母菌分別接入含有葡萄糖和甘油的組成型液體培養(yǎng)基(200 mL/500 mL 三角搖瓶，各1瓶)，30 ℃、200 r/min連續(xù)培養(yǎng)6 d，每隔1天取培養(yǎng)液離心收集上清。取10 μL上述培養(yǎng)液及野生型GS115培養(yǎng)液 (負對照) 上清與等體積二倍點樣緩沖液混勻，沸水煮3 min，標準分子量蛋白質(zhì)取5 μL，然后進行SDS-PAGE檢測，其中濃縮膠為5%，分離膠為12%。取不同培養(yǎng)天數(shù)的10 μL誘導(dǎo)型重組表達的培養(yǎng)液上清進行Western blotting檢測，其中一抗按1∶20 000稀釋，二抗按1∶2 500稀釋，ECL發(fā)光試劑盒中A、B液各取1 mL混勻，均有涂布于所轉(zhuǎn)PV膜上，于暗室中進行X-光片曝光5–20 s。

1.2.5 重組Fip-fve血細胞凝集活性檢測

取酵母發(fā)酵液，6 000 r/min離心5 min收集上清，加硫酸銨至95%飽和，12 000 r/min離心20 min，取蛋白質(zhì)沉淀，重溶于PBS (pH 7.2，10 mmol/L)，透析，超濾，上樣于Sephadex G-100 (1.5 cm×60 cm)進行柱層析，得到初步純化的重組Fip-fve。取健康人血細胞2 mL，2 000 r/min室溫離心5 min。收集血紅細胞，用10 mmol/L PBS (pH 7.2) 反復(fù)洗滌并離心3次，最終調(diào)整血細胞懸浮液為1.5% (V/V)。血細胞凝集反應(yīng)液由25 μL血細胞懸浮液，25 μL重組Fip-fve (終濃度2 μg/mL) 蛋白液和50 μL明膠 (0.2%) 混合，加至96孔血凝板，同時以植物凝集素 (PHA，2 μg/mL) 和天然純化的Fip-fve分別作為正對照，以PBS作負對照，置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。于1.5 h和24 h后肉眼和顯微鏡下觀察血細胞凝集結(jié)果[21]。

2 結(jié)果

2.1 表達載體的構(gòu)建

從金針菇子實體基因組DNA中擴增fip-fve基因，連接至pGM-T載體，經(jīng)測序驗證正確后(結(jié)果未顯示)，再連接至pPIC9上構(gòu)建出誘導(dǎo)型畢赤酵母表達載體pPIC9-FIP-fve，示意圖見圖1，并進行EcoRⅠ、BamHⅠ和KpnⅠ酶切電泳檢測 (圖2)。然后以pgap啟動子替換原載體上的paox1構(gòu)建組成型畢赤酵母表達載體pPIC9-PGAP-FIP-fve。

2.2 重組酵母轉(zhuǎn)化子的獲得與鑒定

將SacⅠ酶切后的線性表達載體pPIC9-FIP-fve和pPIC9-PGAP-FIP-fve轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，在不含氨基酸的MD培養(yǎng)基上進行篩選，獲得的重組酵母轉(zhuǎn)化子以fip-fve引物進行菌落PCR檢測 (圖3)。

2.3 重組Fip-fve的表達與檢測

按著畢赤酵母表達手冊方法[14]，分別進行fip-fve的誘導(dǎo)型和組成型表達，培養(yǎng)基上清用于SDS-PAGE檢測 (圖4、5)，與負對照相比，在14 kDa和17 kDa處明顯有蛋白質(zhì)條帶。重組Fip-fve的表達量用凝膠掃描和分析系統(tǒng)(JYO4S-3C) 進行光密度吸收分析和目的重組

圖1 誘導(dǎo)型畢赤酵母表達載體pPIC9-FIP-fve的示意圖Fig. 1 Plasmid map of the inducible recombinant vector pPIC9-FIP-fve.

圖2 誘導(dǎo)型畢赤酵母重組表達載體pPIC9-FIP-fve的酶切鑒定Fig. 2 Identification of the inducible recombinant vector pPIC9-FIP-fve by enzyme digestion. 1: recombinant vector pPIC9-FIP-fve; 2: the DNA marker DL15 000 (bp); 3: pPIC9-FIP-fve digested with EcoRⅠ; 4: pPIC9-FIP-fve digested with BamHⅠ; 5: pPIC9-FIP-fve digested with KpnⅠ; 6: DNA marker DL2 000 (bp).

圖3 菌落PCR電泳檢測重組畢赤酵母轉(zhuǎn)化子Fig. 3 Colony PCR and agarose electrophoresis of the recombinant P. pastoris transformants. 1: the DNA marker DL500 (bp); 2–9: different recombinant P. pastoris transformants.

Fip-fve含量的換算[22]，在以甲醇為碳源的誘導(dǎo)型表達中第4天表達量最高，為158.2 mg/L，在以葡萄糖和甘油為碳源進行組成型表達分別在第4天和第5天達到最高，分別為46.3 mg/L和29.5 mg/L (結(jié)果未顯示)。同時，以誘導(dǎo)型的重組Fip-fve進行Western blotting檢測，結(jié)果如圖6所示。

圖4 以葡萄糖為碳源的組成型重組Fip-fve的SDS-PAGE檢測Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the constitutive rFip-fve using glucose. 1: the protein marker (kDa); 2: the sample of the wild-type P. pastoris GS115 as the negative control; 3–8: the samples of the constitutive culture at different day (1–6 d).

圖5 以甲醇為碳源的誘導(dǎo)型重組Fip-fve的SDS-PAGE檢測Fig. 5 SDS-PAGE analysis of the inducible rFip-fve using methanol. M: the protein marker (kDa); 1: the sample of the wild-type P. pastoris GS115 as the negative control; 2–6: the samples of the inducible culture at different day (1–5 d); 7: the native Fip-fve as the positive control.

圖6 以甲醇為碳源的誘導(dǎo)型重組Fip-fve的Western blotting檢測Fig. 6 Western blotting analysis of the inducible rFip-fve using methanol. M: the protein marker (kDa); 1: the sample of the wild-type P. pastoris GS115 as the negative control; 2–6: the samples of the inducible culture at different day (1–5 d); 7: the native Fip-fve as the positive control.

2.4 重組Fip-fve血細胞凝集活性的檢測

重組Fip-fve經(jīng)過硫酸銨沉淀和Sephadex-G-100凝膠柱層析純化后，最后獲得29 mg純化重組Fip-fve，并進行人血細胞凝集試驗初步檢測其生物學活性。結(jié)果表明，重組Fip-fve在2 μg/mL就可以明顯凝集人血細胞 (表2)，說明重組Fip-fve具有良好的血細胞凝集活性。

表2 重組Fip-fve血細胞凝集活性檢測Table 2 Hemagglutination test of rFip-fve

3 討論

從天然的金針菇子實體或者菌絲體中提取Fip-fve產(chǎn)量比較低，費時費力，同時也增大了成本。運用現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是基因工程手段進行重組Fip-fve的生產(chǎn)將有效克服上述不足。Ko等曾在大腸桿菌中成功表達fip-fve，但是產(chǎn)量較低，只有5 mg/L，并且重組的Fip-fve僅具有天然蛋白生物學活性的一半[17]。Wu等又將fip-fve在昆蟲細胞中進行表達，獲得具有良好生物學活性的重組蛋白，但是產(chǎn)量依舊較低，僅有6.25 mg/L[18]。Zhang等將該基因引入組氨酸標簽在大腸桿菌中也進行了融合表達與純化，表達效率為22%[23]。而畢赤酵母具有原核細胞和核真核細胞的特點，成為功能蛋白質(zhì)和藥用蛋白質(zhì)重組表達的理想宿主。

畢赤酵母表達有兩種形式，一個是應(yīng)用乙醇氧化酶啟動子 (paox1) 的誘導(dǎo)型表達，該表達模式以甲醇為唯一碳源進行外源基因的誘導(dǎo)表達，其最大特點是表達量高，但是該模式需要更換碳源，同時在表達過程中需要使用甲醇具有一定的危害性和毒性。另外一種是應(yīng)用三磷酸甘油醛脫氫酶 (pgap) 的組成型表達，該表達模式不需要更換碳源，可以是甘油、葡萄糖、油酸等，表達方式較簡單、安全[19]。但是不同的目的蛋白用哪種表達方式效率更高還需要實際進行驗證。呂等在畢赤酵母中同時進行了SAM合成酶 (SAMS)的重組表達，結(jié)果組成型SAMS表達量比誘導(dǎo)型高16.3%[24]。本文分別構(gòu)建了誘導(dǎo)型和組成型表達載體，進行了fip-fve在畢赤酵母GS115中兩種模式的表達，結(jié)果表明兩種模式下均能有效重組表達，而誘導(dǎo)型表達產(chǎn)量 (158.2 mg/L) 是組成型表達產(chǎn)量 (46.3 mg/L) 的3.4倍。其原因可能是paox1的超強啟動子功能，有報道稱該啟動子是目前已知的最強啟動子[25]，另外，誘導(dǎo)型表達過程中更換培養(yǎng)基，進行了酵母菌的富集。此外，在兩種模式下表達的重組Fip-fve均有多條目的蛋白帶的產(chǎn)生，可能是由于畢赤酵母進行了蛋白質(zhì)翻譯后的加工和修飾，尤其是糖基化修飾的緣故[26]。

經(jīng)過初步純化的重組Fip-fve表現(xiàn)出良好血細胞凝集活性，在2 μg/mL時就能明顯凝集人血紅細胞；這與天然Fip-fve一致，說明從畢赤酵母GS115獲得的重組Fip-fve具有良好的血細胞凝集活性和初步的生物學活性，可以進行下一步的研究和開發(fā)。另外，我們還需要調(diào)整和優(yōu)化表達體系和條件，以期獲得更高產(chǎn)量的重組目的蛋白。

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(本文責編 郝麗芳)

Inducible and constitutive expression of fip-fve from Flammulina velutipes in Pichia pastoris GS115

Jingwei Lin1,2, Jia Jia2, Ming Zhong2, Lijing Chen2, Haoge Li2, Zhifu Guo2, Mingfang Qi1, Lixia Liu3, and Tianlai Li1

1 College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China
2 College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110866, Liaoning, China
3 School of Life Sciences, Northeast Normal University, Changchun 130024, Jilin, China

We transformed the fip-fve gene into Pichia pastoris GS115 for inducible and constitutive expression to obtain feasible bioactvie recombinant Fip-fve. The fip-fve gene was cloned from Flammulina velutipes fruting body by PCR and ligated to pPIC9 to construct inducible expression vector pPIC9-FIP-fve, and promotor pgap was used to replace the paox1 to construct constitutive expression vector pPIC9-PGAP-FIP-fve. These two vectors were used to transform P. pastoris by PEG method. The fip-fve was expressed after histamine-absence screening and yeast colony PCR. The inducible expression level reached 158.2 mg/L at the fourth day and the constitutive expression level was 46.3 mg/L and 29.5 mg/L using glucose and glycerol, respectively. The SDS-PAGE and Western blotting both proved the correctness of rFip-fve, and the hemagglutination test indicats the rFip-fve’s bioactivity.

Flammulina velutipes, immunomodulation, Pichia pastoris, constitutive expression

May 19, 2013; Accepted: August 20, 2013

Tianlai Li. Tel: +86-24-88487004; E-mail: tianlaili@126.com

林景衛(wèi), 賈佳, 鐘鳴, 等. 金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白基因fip-fve在畢赤酵母GS115中誘導(dǎo)型和組成型表達. 生物工程學報, 2014, 30(3): 464?471.

Lin JW, Jia J, Zhong M, et al. Inducible and constitutive expression of fip-fve from Flammulina velutipes in Pichia pastoris GS115. Chin J Biotech, 2014, 30(3): 464?471.

Supported by: National Natural Science Foudation of China (No. 31000928).

國家自然科學基金 (No. 31000928) 資助。

時間：2013-9-13 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20130913.0912.002.html