劉巖，呂志強，張存，祝新榮，石團員，鐘石，孟智啟

1 浙江省農業(yè)科學院蠶桑研究所 浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州310021

2 浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021

傳染性法氏囊病 (Infectious bursal disease,IBD) 是目前危害世界養(yǎng)禽業(yè)的三大主要傳染病之一，其病原傳染性法氏囊病病毒 (Infectious bursal disease virus, IBDV) 主要侵害雛雞中樞免疫器官法氏囊，而引起免疫抑制為主的淋巴細胞衰竭綜合癥，進而造成對多種病原的易感性增加和其他疫苗的免疫失敗。預防 IBD的傳統(tǒng)方法是用減毒疫苗或滅活苗免疫雞群，前者效果優(yōu)于后者。但減毒疫苗一般仍保留了對雛雞的中等毒力，基因工程亞單位疫苗則由于實驗技術與成本等問題，產(chǎn)業(yè)化難度較大。與此相比，DNA疫苗則具有不受母源抗體影響、無感染風險、可以同時刺激機體產(chǎn)生體液和細胞免疫反應、成本低廉等優(yōu)點[1]，但目前使用的DNA疫苗需要大劑量才能維持其免疫反應，這與DNA疫苗肌注后，大部分在轉運到組織細胞前發(fā)生降解失活，而致使轉運到組織細胞 (特別是抗原遞呈細胞) 的轉運效率較低[2-4]。

近年來在藥物遞呈上使用的微球技術為這一問題的解決提供了新思路[5-6]。目前微球給藥系統(tǒng)常用載體材料有PLGA、海藻酸鈉、殼聚糖及其衍生物、蠶絲蛋白等生物降解材料。其中，來源于甲殼素脫乙?；a(chǎn)物的殼聚糖(Chitosan，CS) 因其價格低廉、來源廣泛、性質穩(wěn)定、生物相容性和可降解性好、毒性極小等優(yōu)點，已經(jīng)廣泛用作藥物、酶和疫苗的微球載體[7-9]。家蠶絲素蛋白 (Silk fibroin, SF) 是一種源于蠶絲的弱兩性氨基酸材料，與殼聚糖共混可交聯(lián)成半互穿聚合物網(wǎng)絡結構，可彌補殼聚糖球囊韌性差、降解快的缺點；同時也有利于改善單純絲素蛋白干燥后脆性變大、形態(tài)差異大、成型不理想等缺點[10]。為此，本研究利用絲素蛋白-殼聚糖兩種材料為壁材，以 IBDV DNA疫苗為芯材，研制緩釋 DNA微球疫苗，探索預防 IBD的新途徑，為研制新型雞傳染性法氏囊病毒疫苗進行探索性研究。

1 材料與方法

1.1 主要材料

蠶繭由浙江省農業(yè)科學院蠶桑研究所提供；殼聚糖脫乙酰度90%，粘度＜100 cps (購自Sigma公司)；pCI-VP2/4/3質粒[11]含 IBDV 多聚蛋白基因，由浙江大學動物預防獸醫(yī)研究所構建并提供；質粒提取相關試劑、PCR酶及電泳檢測試劑購自上海生工生物工程有限公司；其他生化試劑購自浙江長青化工公司。

1.2 質粒DNA的大量制備與純化

堿裂解法大量抽提制備質粒pCI-VP2/4/3，用Sepharose 2B過柱純化后溶于無菌PBS (pH 7.2)緩沖液中，紫外分光光度法測定核酸樣品的純度和濃度，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 殼聚糖及絲素蛋白溶液的制備

將殼聚糖以 1∶100的浴比溶解于 2%冰乙酸溶液中，形成無色透明粘稠溶液；調節(jié)pH為4.6、5.0、5.5并分別保存?zhèn)溆谩?/p>

配制0.5% Na2CO3水溶液，將剪碎的蠶繭按20 g/L比例投入并加熱煮沸0.5 h，取出用蒸餾水洗凈，重復兩次。50 ℃烘干后稱取適量脫膠蠶絲，按文獻[12]方法在60 ℃下溶解于9.3 mol/L LiBr，或在 80 ℃下溶解于氯化鈣三元溶解體系 (摩爾比為 CaCl2∶C2H5OH∶H2O=1∶2∶8)[13-14]，先將無水C2H5OH和H2O 混合，然后把一定量的脫膠桑蠶絲 (剪成2 cm左右) 浸入其中，潤濕后加入無水CaCl2。攪拌，置60 ℃下繼續(xù)攪拌制得絲素溶膠。再經(jīng)半透膜 (MWCO 3500，Pierce) 在蒸餾水流水透析3 d除鹽，離心棄去溶解過程中的少量凝聚物，確定最后絲素溶液的濃度[15]。

1.4 微球的制備

1.4.1 戊二醛交聯(lián)劑法

[16]方法，取 50 mL液體石蠟和2 mL span-80在55 ℃左右攪拌片刻，緩慢加入1%的殼聚糖、DNA溶液，在55 ℃左右充分攪拌成W/O型乳液。調節(jié)乳液pH值在5.5，滴加pH 5.5的3%絲素蛋白溶液繼續(xù)攪拌，并將pH調至中性，緩慢加入適量戊二醛交聯(lián)，隨后室溫靜置數(shù)小時。產(chǎn)物經(jīng)離心分離、過濾、異丙醇和無水乙醇洗滌以及真空干燥得到粉末狀絲素蛋白殼聚糖DNA微球。

按上述方法，去除滴加絲素溶液和/或pCI-VP2/4/3 DNA溶液步驟，制備出殼聚糖微球、絲素蛋白殼聚糖微球、殼聚糖DNA微球。

1.4.2 Na2SO4沉淀法

參考文獻[17]和[18]在 Na2SO4溶液中配制不同濃度的質粒DNA疫苗，將含DNA的Na2SO4溶液與殼聚糖溶液等比例混合，室溫攪拌10 min，自發(fā)形成乳白色微球，經(jīng) 10 000 r/min離心15 min，棄去懸浮液后，沉淀用無菌水保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 微球性狀的觀察

將不同條件下制備的微球分散在載玻片上，用倒置生物顯微鏡觀察微球形態(tài)，拍照記錄。另取適量微球液，通過激光納米粒度分析儀 (英國Malvern儀器有限公司) 測定其粒徑。參考文獻[19]將微球混合液 20 000×g離心20 min后，取上清溶液測定OD260，根據(jù)如下公式計算微球對DNA疫苗的荷載率：

參考文獻[18]通過在裸 DNA (3 μg溶解在20%的 Na2SO4)、微球懸浮液 10 μL (3 μg DNA)中加入DNaseⅠ，置37 ℃下作用15 min后電泳檢測各組的DNA完整性。

1.6 動物試驗的分組和免疫

14日齡非免疫雞隨機分成5組 (16只/組)，分別為pCI-VP2/4/3質粒免疫組 (A組)、CS/pCIVP2/4/3微球免疫組 (B組)、SF-CS/pCI-VP2/4/3微球免疫組 (C組)、攻毒對照組 (D組) 和正常對照組 (E組)。肌肉多點注射，其中A組注射在 PBS 中溶解的重組質粒 (1.0 μg/μL) 200 μL/只；B組、C組分別測定包封率后按200 μg/只的荷載DNA量進行免疫；首免2 周后進行加強免疫，劑量與首免注射時相同。試驗雞于首免前0 d、首免后7 d、14 d和加強免疫后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d 進行心臟采血，室溫靜置分離血清，并于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 抗IBDV血清ELISA抗體效價的測定

所有試驗組定期隨機采集 4 只雞外周血，室溫靜置分離血清，56 ℃滅活30 min，–20 ℃保存?zhèn)溆谩⒄諅魅拘苑ㄊ夏也〔《綞LISA抗體檢測試劑盒 (購自北京IDEXX生物科技有限公司) 操作說明進行檢測，在650 nm測量記錄吸光值。根據(jù)試劑盒說明計算樣品 (Sample，S) 和陽性對照 (Positive control，P) 的S/P值，檢測各組樣品的 ELISA抗體水平。其中，樣品 S/P值≤0.2，判為陰性；樣品的S/P值>0.2判為陽性。

1.8 攻毒試驗

試驗組雞各取 8只，于加強免疫后 3周時分別攻擊中國標準強毒株BC6/85 株(100 bursal ID50/只，購自中國獸藥監(jiān)察所)，同時設置空白對照組隔離飼養(yǎng)，攻毒后連續(xù)觀察3 d。然后人工捕殺，稱取雞體重、法氏囊重和脾重，計算平均囊體比和脾體比，檢查雞的法氏囊、脾臟等器官的眼觀病變。

1.9 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 11.0軟件包按生物統(tǒng)計學上的方差分析法對平均囊體比、平均脾體比、抗IBDV血清ELISA 抗體效價數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，顯著水平為P<0.05。

2 結果

2.1 絲素蛋白溶液的制備

通過比較三元復合劑、氯化鋰、溴化鋰、稀鹽酸 4種溶劑溶解絲素后發(fā)現(xiàn)：氯化鋰溶液很難溶解絲素蛋白；稀鹽酸60 ℃下長時間處理后，絲素有一定的溶解，但殘余未溶解渣滓較多；三元CaCl2復合溶液、9.3 mol/L的溴化鋰兩種溶液能完全溶解絲素蛋白，溶解后的溶液粘稠微黃；但相比較而言，三元復合劑的溶解速度更快，成本更低。

2.2 Na2SO4沉淀和戊二醛交聯(lián)法制備微球的比較

殼聚糖、DNA疫苗混合絲素蛋白溶液，在Na2SO4鹽溶液作用下，溶液發(fā)生凝聚形成白色濁狀物，離心后出現(xiàn)微球沉積在管底 (圖 1)。殼聚糖和絲素混合液在石蠟和 Span-80乳化下形成白色沉淀，逐滴加入適量戊二醛交聯(lián)后產(chǎn)生出淡黃色微球沉淀。

將Na2SO4沉淀和戊二醛交聯(lián)法制備的微球上清、沉淀分別作為模板，進行IBDV DNA片段的PCR擴增結果發(fā)現(xiàn)，戊二醛交聯(lián)方法制備的殼聚糖DNA微球、絲素蛋白-殼聚糖DNA復合微球上清和沉淀均未擴增到目的條帶；而以Na2SO4沉淀法制備微球沉淀中擴增獲得相應條帶，上清中無對應條帶；表明戊二醛交聯(lián)影響了疫苗DNA正常的擴增反應活性，而Na2SO4沉淀法制備的微球中，荷載DNA能正常擴增 (圖2)。

圖1 Na2SO4沉淀和戊二醛交聯(lián)法制備的微球Fig. 1 Microspheres prepared in glutaraldehyde and Na2SO4 solution. 1: the SF/CS microspheres formed in Na2SO4 solution; 2: the emulsification products treated with paraffin and Span-80; 3: the microspheres products cross-linked by glutaraldehyde.

2.3 SF-CS微球工作條件的建立及其特性

對不同 Na2SO4濃度和殼聚糖 pH值條件下制備微球的檢測發(fā)現(xiàn)：不同Na2SO4濃度條件下均可形成球囊，微球形成速度與Na2SO4濃度呈正相關性，與pH呈負相關性 (圖3)；0.2%以上殼聚糖濃度在包囊效果上差異不明顯，但CS的pH顯著影響微球形成速度和微球粒徑大??；微球粒徑還與絲素蛋白濃度呈正相關關系，但不同絲素蛋白濃度對微球的電泳、DNA擴增活性無明顯影響。綜合微球形態(tài)、荷載DNA活性等的檢測后，研究確定殼聚糖濃度0.5% (pH 5.0)，絲素蛋白濃度0.6%，質粒DNA溶解在2% Na2SO4溶液中，配制成濃度500 μg/mL的工作條件。

圖 2 戊二醛交聯(lián)法和 Na2SO4沉淀制備上清及微球沉淀的PCR擴增結果Fig. 2 PCR product of the microsphere samples cross linked by glutaraldehyde and Na2SO4. 1: PCR product of pCI-VP2/4/3 plasmid as positive control; 2–5 samples were cross-linked by glutaraldehyde while lane 6–7 were prepared in Na2SO4 solution. 1:pCI-VP2/4/3 plasmid; 2: CS/pCI-VP2/4/3 supernatant;3: CS/pCI-VP2/4/3 precipitate; 4: SF-CS/pCI-VP2/4/3 supernatant; 5: SF-CS/pCI-VP2/4/3 precipitate; 6:SF-CS/pCI-VP2/4/3 supernatant; 7: SF-CS/pCIVP2/4/3 precipitate.

圖 3 不同 Na2SO4和殼聚糖 pH對微球形成的影響表現(xiàn)Fig. 3 Effects of Na2SO4 concentration and chitosan pH on the formation of microcapsules.

從圖 4結果可見，微球能有效保護荷載DNA疫苗免受DNaseⅠ的降解，粒徑儀檢測顯示SF-CS/pCI-VP2/4/3微球大小1.98 μm；荷載率89.14%。

圖4 DNase I對微球荷載DNA的消化表現(xiàn)Fig. 4 Digestion performance of different microsphere sample with or without DNaseⅠ. 1: DNA ladder’s three bands (2 000 bp, 1 000 bp and 750 bp from top to bottom) were showed respectively; 2–6 were samples treated before DNaseⅠdigestion while 7–11 were treated after DNaseⅠdigestion. 1: DNA ladder (DL2000); 2: pCI-VP2/4/3 plasmid in TE; 3:pCI-VP2/4/3 plasmid in 2% Na2SO4; 4: SF-CS/pCIVP2/4/3 supematant; 5: SF-CS/pCI-VP2/4/3 precipitate;6: SF-CS/pCI-VP2/4/3 microcapsule mixture; 7: SF-CS/pCIVP2/4/3 supematant; 8: SF-CS/pCI-VP2/4/3 precipitate;9: SF-CS/pCI-VP2/4/3 microcapsule mixture; 10:pCI-VP2/4/3 plasmid in TE; 11: pCI-VP2/4/3 plasmid in 2% Na2SO4.

2.4 抗IBDV血清ELISA抗體效價的測定

DNA 疫苗各試驗組血清抗體效價動態(tài)規(guī)律如圖 5所示，免疫前后不同時間采集各組試驗雞血清，檢測并計算出ELISA抗體水平 (S/P值表示)。首免后2周內各疫苗組的抗IBDV血清ELISA 抗體效價均呈上升趨勢，且相互之間并無明顯差別。2周后的檢測發(fā)現(xiàn)微球DNA疫苗組的抗IBDV 血清ELISA抗體效價開始明顯高于單純pCI-VP2/4/3免疫組(P< 0.05)；特別是絲素蛋白-殼聚糖復合微球組，在之后的血清ELISA抗體效價動態(tài)檢測中呈現(xiàn)更高的上升趨勢，ELISA抗體效價優(yōu)于CS/pCI-VP2/4/3微球疫苗組(P< 0.05)。這說明微球佐劑能更好地保護DNA疫苗，有效誘導抗IBDV血清ELISA抗體。相比較單純的殼聚糖微球，添加絲素蛋白的復合微球對刺激機體產(chǎn)生的抗 IBDV血清ELISA抗體水平更高，這也表明了絲素蛋白所具有的非特異性免疫促進作用 (圖5)。在整個試驗過程中，正常對照組未檢測到抗 IBDV特異性抗體。

圖 5 DNA 疫苗各試驗組外周血抗 IBDV血清ELISA抗體效價動態(tài)規(guī)律Fig. 5 Peripheral blood anti-IBDV ELISA antibody levels of chickens immunized with different DNA vaccines.

2.5 DNA疫苗各試驗組對強毒的攻擊保護效果觀察

在加強免疫3周后，用中國標準強毒株BC6/85攻擊。攻毒3 d觀察發(fā)現(xiàn)攻毒對照組出現(xiàn)IBD典型的臨床癥狀、病理變化和組織學病變。病雞主要表現(xiàn)精神萎頓、羽毛蓬松、拉白色糞便，剖檢發(fā)現(xiàn)法氏囊和脾臟腫大。正常對照組和免疫組雞只精神良好，臨床表現(xiàn)上無明顯差異。剖取法氏囊、脾臟，計算囊體比 (B/B)、脾體比(S/B) 統(tǒng)計結果 (表 1) 顯示：免疫組和正常對照組間囊體比、脾體比值無明顯差異；但均與攻毒對照組間有差異 (P<0.05)。

表1 不同疫苗組免疫后對強毒株BC6/85攻擊的保護效果比較Table 1 Comparison of protective immune responses of different IBDV DNA vaccine immunized chickens challenged by virulent strain BC6/85

3 討論

近年來，傳染性法氏囊病呈現(xiàn)發(fā)病季節(jié)不固定和發(fā)病日齡兩級分化的新特點，并隨著IBDV超強毒株、變異株，以及感染后疫苗接種副作用增加等問題的出現(xiàn)，使整個防治工作變得更加錯綜復雜[20]。除了傳統(tǒng)的減毒和滅活疫苗外，國內外研究者相繼針對 IBDV VP2或VP2/4/3基因開展了大量工作，研究出了不同來源、不同表達系統(tǒng)的 VP2或 VP2/4/3基因工程亞單位疫苗，盡管試驗結果提示這種疫苗有良好的免疫原性，但應用上仍不同程度地受到成本和實驗技術等問題的制約[21]。因為存在易降解、遞呈效率偏低等缺點，IBDV DNA疫苗的應用也受到制約[2,4]。此前學者曾用免疫刺激復合物 (ISCOM)[11]、雞白細胞介素 2[22-23]、雞白細胞介素18[24]與IBDV DNA疫苗配合使用，以促進機體特異性免疫應答。本研究在前人研究基礎上，利用絲素蛋白、殼聚糖兩種生物高分子材料為壁材，以IBDV VP2/4/3 DNA疫苗為芯材，研制出了復合緩釋DNA微球疫苗，并驗證了微球化IBDV DNA疫苗的保護及免疫原性，從血清抗 IBDV ELISA抗體及攻毒保護試驗結果來看，微球特別是絲素-殼聚糖復合微球對機體免疫水平的提高有正促進作用。徐懷英等以殼聚糖為囊材，新城疫病毒液為芯材，戊二醛為交聯(lián)劑，選擇適當乳化系統(tǒng)制備新城疫微球疫苗，免疫SPF雞群后的MTT試驗、血清lgG HI試驗等檢測表明殼聚糖微球疫苗兼具了弱毒活疫苗和滅活苗的優(yōu)點，具有較好的免疫效果[8-9]。Sun等對鴨皰疹病毒 glycoprotein C的DNA疫苗免疫研究中發(fā)現(xiàn)，殼聚糖載體能促進質粒DNA疫苗在鴨體多組織的分布[25]。這也與Tian等[1]和 Plapied等[26]的研究報道相一致。Friede等也認為微球顆粒有緩釋抗原、減少注射劑量和促進抗原遞呈至粘膜組織淋巴細胞的作用[27]。本研究結果證實微球化疫苗具有保護疫苗體內運輸穩(wěn)定性、控制包被抗原緩慢釋放、提高局部抗原濃度、延長抗原刺激時間和使抗體滴度維持較高水平的作用，而且還可保護抗原免受外界不良因素 (如有機溶劑、較低或較高pH環(huán)境、蛋白酶等) 的影響或破壞[28-29]。

殼聚糖微球具有無毒、生物相容性和可降解性，能夠增加腸道淋巴細胞中IgA、IgG水平和激活補體，刺激巨噬細胞活化，增強吞噬能力，促進粘膜中抗原遞呈細胞對抗原的攝取等優(yōu)點[30]；Aaharoff等的研究表明，在沒有其他佐劑的情況下，殼聚糖水溶液能增強由皮下注射蛋白抗原所產(chǎn)生的體液免疫應答和細胞介導的免疫應答[31]；Chirasak等也報道殼聚糖微球能有效遞呈抗原至 DC和 MΦ細胞[32]。但由于單純殼聚糖微球在水中易溶脹，造成荷載藥物的突釋[33]，而且殼聚糖制成的產(chǎn)品凍干后較硬，缺乏彈性[34-35]。來源于蠶絲脫膠后獲得的絲素蛋白，是一種天然高分子纖維蛋白。具有優(yōu)良的生物相容性、力學強度和柔韌性。絲素及其降解產(chǎn)物氨基酸對組織無毒性、無致敏和無刺激作用。絲素中含有豐富的酰胺基和少量羥基，可與殼聚糖形成氫鍵，破壞殼聚糖鏈本身之間的氫鍵，使殼聚糖中的一部分氨基得以自由。將絲素和殼聚糖這兩種天然高分子物質共混，就可以克服單一組分的缺點。劉麗萍等以殼聚糖/絲素復合高分子為骨架材料研制了 5-Fu磁微球，研究發(fā)現(xiàn)其在藥物的緩釋和靶向定位方面具有一定的應用價值[36]；張幼珠等以消炎痛藥物為芯料，通過復凝聚法制備再生絲素蛋白-殼聚糖包藥微球、單凝聚法制備殼聚糖包藥微球，經(jīng)比較形貌、粒徑、包囊率、釋藥率等質量指標后發(fā)現(xiàn)，絲素-殼聚糖包藥微球成囊，包囊率高，藥物釋放效果更好[33]。張文元等對SF/CS形成的復合材料體外研究發(fā)現(xiàn)，SF/CS共混材料具有良好的細胞相容性，對BMSC細胞無毒，是組織工程中很有應用前景的一種材料的研究[37]。本研究將絲素蛋白與殼聚糖共混制備的復合微球DNA疫苗，免疫效果也表現(xiàn)更佳；與前人[37-38]研究結果相吻合。這種功能可能一方面與雙層膜微球球壁增厚，以及雙層膜間層間所具有的緩沖室功能有關[33]；另一方面也與絲素蛋白具有抗腫瘤、免疫刺激等功能有關[39]。

本研究利用了戊二醛和 Na2SO4兩種交聯(lián)劑，盡管都可以形成微球，但從DNA活性檢測上發(fā)現(xiàn)前者對DNA活性影響很大，這可能與戊二醛交聯(lián)時與包封的DNA疫苗發(fā)生共價結合有關[40]；而在適量Na2SO4環(huán)境下，陰離子與殼聚糖所荷的正電荷發(fā)生乳化-離子交聯(lián)，制備微球DNA疫苗中，不影響 DNA活性。類似的還有用 TPP[41]等陰離子試劑發(fā)生離子交聯(lián)的原理來制備微球的報道。微球的形成及粒度大小的均勻度與工作條件 (如鹽溶液濃度、DNA疫苗濃度、操作溫度和攪拌速度) 密切相關；各材質質量配比顯著影響微球形態(tài)和形成過程，這使得通過可控性調節(jié)各種材料濃度、配比以改變微球的顯微結構，最終獲得達到預期標準的微球成為可能。但這些變量因素也降低了實驗的可重復性，實驗條件稍微改變就會使微球結構改變，加之制備材料無統(tǒng)一的質量標準，更增加了實驗的難度。建立穩(wěn)定高效的微球疫苗工藝需要更多的細致工作，譬如對不同條件下微球的形態(tài)結構、釋藥速度、累積釋放率、保存條件、保存時間和免疫試驗途徑等尚需進一步研究?？傮w而言，隨著今后安全、靶向、控釋、緩釋型微球佐劑的研究的不斷深入，微球化技術有望在疫苗、藥物等領域有更廣泛的應用。致謝：感謝浙江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所陳柳、倪征老師在動物試驗方面給予的大力支持，感謝何麗華、沈衛(wèi)鋒、陳金娥在動物攻毒和淋巴細胞檢測中提供的幫助。

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