曾妍，龔燕燕，鄔敏辰，殷欣，唐存多

1 江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122

2 江南大學無錫醫(yī)學院，江蘇 無錫 214122

3 江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122

阿魏酸酯酶 (Feruloyl esterase, E.C.3.1.1.73)是羧酸酯水解酶的一個亞類，可以水解植物細胞壁中多糖與阿魏酸連接的酯鍵，并釋放出游離的阿魏酸單體或二聚體。阿魏酸酯酶的來源比較廣泛，目前已有許多關(guān)于微生物來源的阿魏酸酯酶的分離純化、基因克隆和異源表達等[1-3]的報道。Mathew等[4]對黃柄曲霉Aspergillus flavipes進行了液體深層發(fā)酵，獲取了阿魏酸酯酶，最高酶活可達 6.82 U/mL。張帥兵等[5]克隆了黑曲霉Aspergillus niger的A型阿魏酸酯酶基因，并在畢赤酵母中實現(xiàn)了異源表達，酶活為16.6 U/mL。在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域中，利用阿魏酸酯酶來降解植物細胞壁中的阿魏酸酯鍵，可以得到有藥用價值和保健功能的游離阿魏酸[6-7]。阿魏酸是桂皮酸的一種衍生物，其化學名稱為4-羥基-3-甲氧基肉桂酸，也是一種天然的抗氧化劑，對心血管疾病、糖尿病、老年癡呆癥和腫瘤等疾病有治療作用[8-9]。目前阿魏酸的生產(chǎn)方法主要包括化學合成法和堿解法，但這兩種方法均存在一定的缺陷[10]?；瘜W合成法反應(yīng)步驟多、周期長；堿解法的原料谷維素在米糠中含量低，產(chǎn)量受限；此外，這兩種方法都具有污染性，因此酶法生產(chǎn)阿魏酸成為近年來研究的熱點[11]。然而，酶解液是一個復雜的體系，從中分離出阿魏酸仍比較困難。尋找合適的阿魏酸純化工藝也是實現(xiàn)阿魏酸工業(yè)化生產(chǎn)所需要突破的一個瓶頸。

米曲霉Aspergillus oryzae安全性高、不產(chǎn)毒素，應(yīng)用于食品工業(yè)歷史悠久[12]，因此從米曲霉中提取的阿魏酸酯酶應(yīng)用于藥品、食品等行業(yè)安全性也很高。另外，目前國內(nèi)外均未見關(guān)于米曲霉阿魏酸酯酶A基因克隆與表達的研究報道。本研究利用購買的具有產(chǎn)阿魏酸酯酶能力的A. oryzaeCICC 40186菌株，結(jié)合生物信息學分析的手段，借助RT-PCR技術(shù)克隆了編碼米曲霉阿魏酸酯酶A (AorFaeA) 的cDNA片段，并實現(xiàn)了其在畢赤酵母GS115中的分泌表達。此外，研究了利用大孔樹脂從小麥麩皮酶解液中分離阿魏酸的工藝條件。本研究為阿魏酸的酶法“綠色生產(chǎn)”及應(yīng)用奠定了堅實的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體

米曲霉A. oryzae購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號為CICC40186；大腸桿菌Escherichia coliJM109和 DH5α、畢赤酵母Pichia pastorisGS115和表達載體 pPIC9K為本實驗室保存；克隆載體pUCm-T購自上海Sangon生物工程有限公司；GS115/Aoxyn11A由本實驗室構(gòu)建與保存[13]。

1.2 工具酶、引物和試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和Taq酶等工具酶購自大連 TaKaRa生物工程有限公司；PCR引物由上海Sangon公司合成；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、DNA marker、蛋白質(zhì) marker、YNB、生物素、酵母粉、蛋白胨、geneticin G418、UNIQ-10柱式 Trizol總 RNA抽提試劑盒和EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit購自上海Sangon公司；標準反式阿魏酸與阿魏酸甲酯購自鹽城朗德化學有限公司；大孔吸附樹脂購自河北滄州寶恩化工有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 培養(yǎng)基

種子活化培養(yǎng)基：2%玉米粉，3%豆餅粉，3% KH2PO4，1% CaCl2，1% MgSO4；誘導培養(yǎng)基 (用于總 RNA的提取)：0.9% NaNO3，0.05%KH2PO4，0.05% MgSO4，0.4%酵母提取物，20%麩皮提取液；LB、YPD、MD、BMGY和BMMY培養(yǎng)基參考Invitrogen公司的Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計及合成

根據(jù)A. oryzaeRIB40菌株基因組中阿魏酸酯酶 A的基因序列(GenBank Accession No.XM_001818700)和表達質(zhì)粒 pPIC9K 上的多克隆位點，設(shè)計出一對擴增編碼 AorFaeA成熟肽cDNA的特異性上下游引物，向上游引物FaeA-F中引入EcoRⅠ酶切位點，向下游引物 FaeA-R中引入NotⅠ酶切位點，引物由上海 Sangon公司合成 (表 1)。

表1 擴增目的基因AorfaeA的PCR引物Table 1 PCR primers for amplification of target gene AorfaeA

1.4.2 AorFaeA成熟肽編碼基因的克隆

將斜面保藏的A. oryzae菌種接種于種子活化培養(yǎng)基，于30 ℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，以2%的接種量轉(zhuǎn)至誘導培養(yǎng)基中，于同樣條件下培養(yǎng)24 h后收集菌體，用UNIQ-10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取A. oryzae的總RNA。以總RNA為模板，參照RT-PCR試劑盒說明書，以oligo (dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA的第一條鏈。然后以cDNA的第一鏈為模板，以FaeA-F為上游引物，依次以oligo (dT)-M13 Primer M4和FaeA-R為下游引物，進行兩輪PCR，擴增出編碼AorFaeA成熟肽的cDNA。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶。將回收的產(chǎn)物與 pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E. coliJM109，送上海Sangon測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-AorfaeA。

1.4.3 AorFaeA成熟肽編碼基因在畢赤酵母中的表達

測序正確的重組質(zhì)粒 pUCm-T-AorfaeA經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，將目的基因連接至表達質(zhì)粒pPIC9K，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α，經(jīng)測序鑒定，重組表達質(zhì)粒命名為 pPIC9K-AorfaeA。pPIC9K-AorfaeA用SalⅠ線性化，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布于MD平板上篩選重組子，取MD平板上生長良好的菌落用牙簽點種至含0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL G418的YPD平板上，篩選抗4.0 mg/mL G418的畢赤酵母重組子，命名為GS115/AorfaeA。分別提取 GS115/AorfaeA及 GS115/9K基因組DNA，利用通用引物5'-AOX和3'-AOX進行PCR鑒定。重組酵母 GS115/AorfaeA的誘導表達及SDS-PAGE分析參見文獻[14]和[15]。

1.4.4 重組阿魏酸酯酶 (reAorFaeA) 的分離純化與活性測定

將誘導表達的發(fā)酵液加入固體(NH4)2SO4粉末至80%飽和度，10 000 r/min離心10 min，收集沉淀復溶于一定體積的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6.0)，經(jīng)超濾濃縮后過凝膠柱Sephadex-75，收集洗脫峰用于酶活測定，并利用Bradford法測定蛋白含量[16]。

reAorFaeA酶活測定參照 Zhang等[17]的方法略做改動。取900 μL用0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.0)配制的1 mmol/L的阿魏酸甲酯于 EP管中，45 ℃預(yù)熱 10 min，加入 100 μL稀釋適當倍數(shù)的酶液，準確反應(yīng) 10 min后加入400 μL冰乙酸終止反應(yīng)，立即混勻進行高效液相色譜 (HPLC) 分析，在 320 nm下測定經(jīng)reAorFaeA水解后產(chǎn)物中阿魏酸的釋放量。以預(yù)先在酶溶液中加入400 μL冰乙酸，再加底物溶液的反應(yīng)物為對照。在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生 1 μmol阿魏酸所需的酶量定義為一個酶活性單位 (U)。

色譜條件：戴安 UltiMate-3000高效液相色譜儀，C18 5 μm ODS 反相色譜柱(260 mm×4.6 mm)，柱溫30 ℃，進樣量 20 μL。流動相組成為 A：100%甲醇，B：1%乙酸(V/V)，一步梯度洗脫，0 min，50% B、10 min，20% B，UV檢測波長為320 nm，洗脫流速為1 mL/min。

1.4.5 阿魏酸粗提液的制備

按 1.4.3誘導表達重組酵母 GS115/AorfaeA[18]和GS115/Aoxyn11A，分別獲得reAorFaeA和重組木聚糖酶 (reAorXyn11A)，reAorXyn11A的酶活按文獻[13]的方法測定。準確稱取0.5 g去淀粉麩皮于100 mL錐形瓶中，加入8 mL reAorFaeA酶液(約16.88 U)和0.5 mL reAorXyn11A酶液(約72.5 515 U)，用0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 5.0)定容至30 mL，于40 ℃酶解10 h，煮沸5 min滅酶活，離心收集上清液即為阿魏酸粗提液。

1.4.6 大孔樹脂的預(yù)處理

將大孔樹脂置于容器中，用95%乙醇浸泡24 h使其充分溶脹，以乙醇濕法轉(zhuǎn)移柱內(nèi)(層析柱：2 cm×30 cm)繼續(xù)用乙醇流動清洗，至1份乙醇加3份水不產(chǎn)生白色渾濁，再用清水沖洗至無醇味，備用。

1.4.7 靜態(tài)吸附解吸

選擇D-101、HPD-100、HPD-300、HP-20和AB-8五種型號樹脂 (表2)，以阿魏酸吸附量和解吸率為標準，篩選最適樹脂。稱取處理好的樹脂各1 g，分別加入所制備的阿魏酸粗提液50 mL，于25 ℃、120 r/min恒溫振蕩搖床上吸附24 h，測定上清液中阿魏酸的含量。用去離子水洗滌樹脂后，加入95%乙醇50 mL，于25 ℃、120 r/min恒溫振蕩搖床上解吸附24 h，測定解吸液中阿魏酸的含量，計算各樹脂的吸附量和解吸率。

1.4.8 大孔樹脂純化工藝

室溫下，樹脂裝填量為50 mL，高度為15 cm。將阿魏酸粗提液濃縮至濃度為0.1 mg/mL，取10 mL上柱靜置吸附2 h，水洗柱子每1個柱體積(BV) 收集一份水洗液，檢測水洗液中還原糖和阿魏酸的含量，還原糖和阿魏酸的測定分別采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS)法和HPLC法。至流出液中無還原糖時，用洗脫液洗脫，定量收集、測定洗脫液中阿魏酸的質(zhì)量濃度，并計算回收率。洗脫液進行減壓濃縮、干燥，測定總固物重量，同時計算阿魏酸粗提液總固體物中阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)和洗脫液總固體物中阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)（即純度）。阿魏酸的回收率 (%) = (洗脫液中阿魏酸的質(zhì)量濃度×洗脫液體積) / (粗提液中阿魏酸的質(zhì)量濃度×粗提液體積) ×100%；阿魏酸的純度 (%) = (洗脫液中阿魏酸的質(zhì)量濃度×洗脫液體積) /洗脫液總固體質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 AorFaeA成熟肽編碼基因的克隆及表達質(zhì)粒的構(gòu)建

以A. oryzae的總RNA為模板，F(xiàn)aeA-F分別和oligo (dT) -M13 Primer M4、FaeA-R為引物按照1.4.2中的方法進行兩輪RT-PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析，第一輪 PCR在約1 000 bp處出現(xiàn)一條特異性條帶(圖1，泳道1)，第二輪PCR在約800 bp位置處出現(xiàn)一條特異性條帶(圖 1，泳道 2)，其大小與預(yù)期的相符。將目的產(chǎn)物割膠回收后與質(zhì)粒 pUCm-T連接，轉(zhuǎn)化E. coliJM109獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒送上海Sangon公司測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pUCm-T-AorfaeA。結(jié)果表明，目的基因長度為783 bp，編碼260個氨基酸。Blast分析結(jié)果表明該序列與黑曲霉Aspergillus niger faeA(GenBank Accession No. ADI70526.1)的序列同源性為 71%，與土曲霉Aspergillus terreusNIH2624faeA(GenBank Accession No.XP_001217493.1) 的序列同源性為 71%，與塔賓曲霉Aspergillus tubingensisfaeA(GenBank Accession No. CAA70511.1) 的序列同源性為74%。將重組質(zhì)粒 pUCm-T-AorfaeA用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切及割膠回收，與經(jīng)同樣雙酶切后回收的質(zhì)粒pPIC9K連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，篩選獲得重組質(zhì)粒 pPIC9K-AorfaeA，將重組質(zhì)粒 pPIC9K-AorfaeA送上海 Sangon公司測序，測序結(jié)果與預(yù)期的一致。

圖1 AorfaeA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR products of AorfaeA. M: DNA marker; 1: the first round of PCR product; 2: the second round of PCR product.

2.2 AorfaeA基因在畢赤酵母中的表達

參考Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊，以及陳小芳等[19]篩選高拷貝重組子所采用的方法，轉(zhuǎn)化子的拷貝數(shù)與其抗G418的能力有關(guān) (如 0.5 mg/mL G418對應(yīng)于 1–2個拷貝)，通過篩選抗高濃度 G418的酵母即可獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子。以篩選到的抗4.0 mg/mL G418高拷貝重組畢赤酵母 GS115/AorfaeA的基因組為模板，用5'-AOX和3'-AOX引物進行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示以GS115/AorfaeA基因組為模板的PCR產(chǎn)物在約1 300 bp和2 100 bp處有兩條特異性的條帶(圖2，泳道1)，而以GS115/9K基因組為模板的PCR產(chǎn)物在500 bp和2 100 bp處出現(xiàn)DNA條帶(圖2，泳道 2)，結(jié)果表明目的基因AorfaeA已成功整合入 GS115基因組內(nèi)。挑取幾個高拷貝的重組子按照 Multi-CopyPichiaExpression Kit操作手冊中的方法進行誘導表達，篩選到一個產(chǎn)酶活性最高的GS115/AorfaeA重組子，其發(fā)酵上清液的酶活為2.11 U/mL，SDS-PAGE分析條帶不唯一(圖3，泳道 1)，發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨沉淀及凝膠層析純化后，SDS-PAGE分析得到一條清晰的條帶(圖3，泳道2)，純化后的酶液比酶活為58.35 U/mg，相比于Koseki等[20]在畢赤酵母中表達的泡盛曲霉Aspergillus awamoriAwfaeA的酶活(9.01±0.89) U/mg達較高水平。SDS-PAGE的結(jié)果顯示reAorFaeA的表觀分子量約為39.0 kDa，明顯大于其理論分子量，用 NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 對翻譯后加工的 N糖基化位點進行預(yù)測，結(jié)果表明reAorFaeA氨基酸序列中含有兩個潛在 N-糖基化位點，從而使得 reAorFaeA的表觀分子量較其理論分子量有所增大。

圖2 重組畢赤酵母GS115/AorfaeA的PCR鑒定Fig. 2 Identification of recombinant Pichia pastoris GS115/AorfaeA by PCR. M: DNA marker; 1: PCR product of GS115/AorfaeA; 2: PCR product of GS115/9K.

圖3 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE profile of expressed products. M:protein marker; 1 and 2: the expression products of GS115/AorfaeA unpurified and purified, respectively.

2.3 不同大孔樹脂對阿魏酸的吸附量和解吸率的測定

因為阿魏酸為弱極性物質(zhì)，相對于強極性大孔吸附樹脂，其在非極性或弱極性大孔樹脂上的吸附和解吸效果均較好[21]。按照1.4.7中的方法測定5種大孔樹脂對阿魏酸粗提液中阿魏酸的吸附量和解吸率，結(jié)果顯示HPD-300型大孔樹脂的吸附量和解吸率均較高 (表 3)，通過比較這幾種樹脂的物理性質(zhì) (表2)，發(fā)現(xiàn)HPD-300型大孔樹脂的比表面積較大，而較大的比表面積有利于酚酸類物質(zhì)在樹脂表面形成更加有序的排列，增加吸附過程中的氫鍵作用和π-π作用位點，從而提高大孔樹脂對酚酸類物質(zhì)的選擇性。故選擇 HPD-300型大孔樹脂用于純化阿魏酸的工藝研究。

表2 各類大孔樹脂物理性質(zhì)Table 2 Physical properties of macroporous resins

表3 靜態(tài)吸附解吸結(jié)果Table 3 Static adsorption analytic results

2.4 洗脫液濃度對阿魏酸洗脫效果的影響

分別將10 mL處理好的阿魏酸粗提液上柱后靜置吸附2 h，用去離子水進行洗滌除去多糖等雜質(zhì)，當水洗液為4 BV時流出液中不含有還原糖，經(jīng)HPLC檢測，流出液中均不含有阿魏酸。然后分別選用30%、50%和70%濃度的乙醇溶液以l.0 mL/min的流速進行洗脫，每l BV收集一份洗脫液，共收集7 BV，分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，復溶于10 mL乙醇中，測量其中阿魏酸的含量。結(jié)果如圖4A所示。由圖4A可見30%的乙醇不易將阿魏酸洗脫下來，另外，70%乙醇洗脫液在洗脫時顏色較深，表明過高濃度的乙醇會將色素等雜質(zhì)一并洗脫，因此宜選擇50%乙醇溶液作為洗脫液。

2.5 洗脫液流速對阿魏酸洗脫效果的影響

分別采用 0.5 mL/min、l.0 mL/min和2.0 mL/min的流速對樹脂進行洗脫，每l BV收集一份洗脫液，共收集7 BV，分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干，復溶于10 mL乙醇中，測量其中阿魏酸的含量。結(jié)果如圖4B所示。由圖4B可見在一定流速范圍內(nèi)，流速越慢，洗脫效果越好。這可能是因為洗脫液流速越慢，越有利于樹脂中阿魏酸解吸于洗脫液中。在 0.5 mL/min和 l.0 mL/min的洗脫流速下，阿魏酸的洗脫量較大，洗脫效果差別不大，4 BV洗脫液可洗脫完全，從縮短生產(chǎn)周期的角度出發(fā)，選擇l.0 mL/min的流速進行洗脫。

2.6 驗證試驗

室溫下，樹脂裝填量為50 mL，將阿魏酸粗提液濃縮至0.1 mg/mL，上樣量為10 mL，靜置吸附2 h，然后用4 BV去離子水沖洗以除去還原糖等雜質(zhì)，用50%乙醇溶液以1.0 mL/min流速進行解吸，收集洗脫液4 BV，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，真空低溫干燥成粉末，稱重為8.72 mg，阿魏酸的純度為10.55%，回收率為92%。而純化前粗提物總固體物中阿魏酸的質(zhì)量分數(shù)為0.13%，純化倍數(shù)達到了 81.2，表明采用大孔吸附樹脂純化小麥麩皮中阿魏酸效果良好。

圖4 洗脫液濃度及洗脫液流速對阿魏酸洗脫效果的影響Fig. 4 Effects of different concentrations of ethanol and flow speeds on elution of ferulic acid. (A) Change of ferulic acid concentration with different ethanol contents. (B) Change of ferulic acid concentration with different flow speeds.

3 討論

本研究首次成功實現(xiàn)了米曲霉AorfaeA在P. pastorisGS115中的分泌表達，以阿魏酸甲酯為底物，其發(fā)酵上清液的粗酶活可達到2.11 U/mL，reAorFaeA經(jīng)硫酸銨沉淀及凝膠層析純化后，比酶活為58.35 U/mg。經(jīng)SDS-PAGE檢測reAorFaeA的表觀分子質(zhì)量約為39.0 kDa，明顯大于其理論分子量。由于畢赤酵母表達體系可以對蛋白質(zhì)進行糖基化修飾作用[22]，并且經(jīng)NetNGlyc 1.0預(yù)測表明reAorFaeA氨基酸序列中含有兩個潛在N-糖基化位點，因此推測reAorFaeA可能是經(jīng)過糖基化修飾后的蛋白，使得其表觀分子量大于理論分子量。

José等[23]研究了醇提水沉法，活性炭吸附法和聚乙烯吡咯烷酮 (PVPP) 吸附法3種方法純化阿魏酸，醇提水沉法步驟復雜，需要多步沉淀，回收率為 57%；活性炭吸附分離阿魏酸，回收率為66%，可除去大部分色素，但活性炭的再生能力差，且分離過程中使用乙酸乙酯等有機溶劑，對環(huán)境有污染；PVPP純化阿魏酸其回收率較低，為 51.8%。大孔樹脂與其他天然吸附劑相比具有吸附性強、解吸附容易、可反復使用、流體阻力小、價格便宜、操作簡單，抗污染能力強等優(yōu)點[24]。特別是其孔徑和孔度大小、比表面積、極性等性能都可以人為控制調(diào)節(jié)，供任意選擇，在對天然產(chǎn)物進行大孔樹脂純化后，可以去除大部分糖類和水溶性雜質(zhì)。本研究探索了利用大孔樹脂從阿魏酸粗提液中純化阿魏酸的工藝，基于測定出的不同樹脂對阿魏酸的吸附量和解吸率，本研究選用HPD-300型大孔樹脂探索從阿魏酸粗提液中純化阿魏酸的工藝條件，確定了最佳純化條件為：上樣量10 mL，靜置吸附2 h，用4 BV去離子水沖洗以除去還原糖等雜質(zhì)，用4 BV 50%的乙醇溶液以1.0 mL/min流速進行解吸，純化后阿魏酸的回收率為92%，純度為10.55%，較阿魏酸粗提液純化了81.2倍。

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