銀曉晶，廖 栩，張 瑜，何 蕊，王淑君*

(1. 沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 沈陽鑫泰格爾醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，遼寧 沈陽 110034；3. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

聚乙二醇對7-乙基-10-羥基喜樹堿體外穩(wěn)定性及對小鼠淋巴攝取的影響

銀曉晶1，廖 栩2，張 瑜1，何 蕊3，王淑君3*

(1. 沈陽藥科大學 中藥學院，遼寧 沈陽 110016；2. 沈陽鑫泰格爾醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司，遼寧 沈陽 110034；3. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽 110016)

目的本文研究不同相對分子質量的聚乙二醇（PEG）溶解7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38)對其體外穩(wěn)定性以及小鼠淋巴攝取量的影響。方法 體外實驗在SN-38的pH值7.4的PBS飽和溶液中分別加入乙醇、PEG200、PEG400、PEG800，37 ℃水浴12 h，用HPLC測定SN-38含量；在體內實驗中分別將SN-38用乙醇及含體積分數(shù)50%PEG200-800的乙醇溶液配制成質量濃度為1 g·L-1的SN-38溶液劑，將上述SN-38的溶液劑在小鼠右后腳掌皮下注射，劑量為1 mg·kg-1。給藥后分別于不同時間點用HPLC測定小鼠淋巴結及腳掌中的SN-38的含量。結果 體外的穩(wěn)定性實驗測得SN-38含量為PEG200組＞PEG400組＞PEG800組＞乙醇組；乙醇組與PEG200-800組小鼠淋巴結中藥物的含量結果與體外穩(wěn)定性結果一致。結論 PEG能夠穩(wěn)定SN-38的內酯環(huán)從而增強SN-38的淋巴攝取量，并且隨著PEG相對分子質量的增加，這種穩(wěn)定作用減弱。

藥劑學；7-乙基-10-羥基喜樹堿；聚乙二醇；皮下給藥；內酯環(huán)穩(wěn)定性；淋巴攝取

7-乙基-10-羥基喜樹堿(7-ethyl-10-hydroxycamptothecin, SN-38)是伊立替康(iritecan, CPT-11)的活性代謝產物，是喜樹堿經化學結構修飾而制得的衍生物。SN-38具有抗癌作用強、抗癌活性高，其活性幾乎是CPT-11的100～1 000倍[1-2]，但是SN-38的溶解性差、內酯環(huán)不穩(wěn)定及嚴重的毒性限制了其臨床應用[3]。SN-38的α-內酯環(huán)是其抗癌活性的關鍵部位，內酯環(huán)開環(huán)會導致喜樹堿及其衍生物完全失去活性[4]。SN-38在酸性和堿性條件下存在形式不同，在酸性條件下是內酯環(huán)形式（SN-38A）即活性形式，而堿性條件下是羧酸鹽形式（SN-38I）[5-6]。在實驗中為了增加SN-38的溶解度加入了PEG，作者發(fā)現(xiàn)PEG的加入不僅增加了SN-38溶解度而且對SN-38的內酯環(huán)也有穩(wěn)定作用，與此同時，對小鼠淋巴攝取量也有很大的改善。因此，作者用不同相對分子質量的PEG溶解SN-38考察其在體外對SN-38內酯環(huán)的穩(wěn)定作用，及其對小鼠淋巴攝取量的影響。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（紫外SPD-10A 檢測器、LC-15C液相泵，日本Shimadzu 公司），RE52CS真空旋轉蒸發(fā)儀（上海生化亞榮儀器廠），SHB-3循環(huán)水式多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠），SCQ2201超聲波清洗器（上海聲彥超聲波儀器有限公司），JY92-2D超聲波細胞粉碎機（寧波新芝儀器研究所），pH計（上海宇隆儀器有限公司），TGL-18C快速離心機（上海安亭科學儀器廠），HC-2062高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司），SK-1快速混勻器（江蘇金壇榮華儀器制造有限公司），MD200 氮氣吹掃儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

肝素鈉注射液（天津生化制藥廠），7-乙基-10-羥基喜樹堿（荊門帥邦化學科技有限公司），喜樹堿（四川南部誠信科技有限公司），磷酸二氫鈉、磷酸（天津博迪化工有限公司），PEG200（天津瑞金特化學品有限公司），PEG400（天津博迪化工股份有限公司），PEG800（天津光復精細化工研究所），無水乙醇（分析純，天津富宇精細化工有限公司），乙腈、甲醇（色譜純，天津康科德公司），其他試劑（分析純，市售）。

昆明種小鼠6～8周齡，(20±2) g，雄性，由沈陽藥科大學動物試驗中心提供，合格證號211002300000821，許可證號SCKK（遼）2010-0001。

2 方法與結果

2.1 SN-38A 和SN-38I 體外含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件

色譜柱：德國CenturySIL BDS C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：25 ℃，流動相：NaH2PO4與Na2HPO4緩沖鹽溶液(25 mmol·L-1，pH = 3.1)-乙腈(體積比70︰30)，流速：1.4 mL?min-1，紫外檢測波長：381 nm，進樣量：20 μL。

2.1.2 專屬性實驗

分別取SN-38I、SN-38A和二者混合溶液，各取20 μL注入液相色譜儀，按“2.1.1”條色譜條件分析測定，色譜圖見圖1。由圖1可知，二者在該液相條件下能夠很好的分離。

圖1 液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatogram

2.1.3 標準曲線的制備

SN-38A標準曲線：精密稱取SN-38適量，用乙腈溶解并定量稀釋成質量濃度為100 mg?L-1的SN-38貯備液。精密量取SN-38貯備液適量，用含體積分數(shù)0.5%乙酸的乙腈溶液稀釋配成SN-38A不同質量濃度的標準溶液。分別吸取各標準溶液20 μL，按“2.1.1”條色譜條件測定。以峰面積(A)對質量濃度(ρ, mg·L-1) 進行線性回歸，求得SN-38A 的標準曲線方程為A=5.759 8×104ρ+8.423 7×104，r=0.999 8，SN-38 A質量濃度在0.1～10 mg·L-1內與峰面積呈良好的線性關系。

SN-38I標準曲線：精密稱取SN-38適量，用乙腈溶解并定量稀釋成質量濃度為100 mg?L-1的SN-38貯備液。精密量取SN-38貯備液適量，用pH值10.0的PBS溶液稀釋配成SN-38I不同質量濃度的標準溶液。分別吸取各標準溶液20 μL，按“2..1.1”條色譜條件測定。以峰面積(A)對質量濃度 (ρ，mg·L-1) 進行線性回歸，求得SN-38I 的標準曲線方程為A=4.604 2×104ρ+17.88，r=0.999 9，SN-38 I質量濃度在0.1～10 mg·L-1內與峰面積呈良好的線性關系。

經方法學驗證，該方法精密度、準確度良好，符合方法學要求。

2.2 SN-38在不同相對分子質量PEG中的體外穩(wěn)定性實驗

2.2.1 溶液的配制

稱取過量的SN-38置于量瓶中，加入pH值7.4的PBS，超聲，0.45 μm的濾膜過濾得到SN-38的飽和溶液。取5 mL SN-38飽和溶液4份置于4個10 mL量瓶中，分別用乙醇、PEG200、PEG400、PEG800稀釋至刻度，得到SN-38在不同相對分子質量PEG中的溶液。

2.2.2 樣品含量測定

將“2.2.1”條配制的SN-38在不同相對分子質量PEG的溶液置于37 ℃水浴中，30 r·min-1磁力攪拌12 h，取出樣品，HPLC進樣分析，測定SN-38A和SN-38I的峰面積，代入標曲計算質量濃度。SN-38A所占比例為閉環(huán)質量濃度比開環(huán)與閉環(huán)總的質量濃度。所得結果見表1。

表 1 SN-38A在不同PEG溶液中的百分比Table 1 The proportion of SN-38A in different PEG solutions

由結果可知，SN-38A在不同相對分子質量PEG中所占比例為PEG200＞PEG400＞PEG800＞乙醇。

2.3 SN-38體內HPLC分析方法的建立

2.3.1 色譜條件

方法同“2.1.1”條。

2.3.2 溶液的配制

SN-38A標準溶液的配制：精密稱取SN-38適量，用乙腈溶解并定量稀釋成質量濃度為100 mg?L-1的SN-38貯備液，于4 ℃冰箱保存。精密量取SN-38貯備液適量，用含體積分數(shù)0.5%乙酸的乙腈溶液稀釋成質量濃度分別為25、50、100、1 000、2 500、5 000 mg?L-1的系列標準溶液。

內標液的配制：精密稱取喜樹堿適量，加入含體積分數(shù)0.5%乙酸的乙腈溶液溶解并稀釋至5 000 mg?L-1的溶液，作為內標液，于4 ℃冰箱保存。

2.3.3 血漿樣品的處理方法

精密吸取小鼠血漿樣品50 μL置于1.5 mL離心試管中，加入喜樹堿內標液50 μL，渦旋30 s，加入含體積分數(shù)0.5%乙酸的乙腈溶液150 μL，旋渦1 min，于16 000 r·min-1離心10 min。小心吸取上清液至另一干凈的1.5 mL的EP管中，50 ℃氮氣流下吹干，干燥后樣品加入50 μL流動相復溶，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣，進行HPLC分析，測定SN-38(A)的含量。

2.3.4 淋巴結樣品的處理方法

取小鼠淋巴結，按每個淋巴結加入100 μL生理鹽水勻漿。精密移取淋巴結勻漿樣品50 μL，置于1.5 mL離心試管中，加入喜樹堿內標液50 μL，渦旋30 s，加入含體積分數(shù)0.5%乙酸的乙腈溶液150 μL，旋渦1 min，于16 000 r·min-1離心10 min。小心吸取上清液至另一干凈的1.5 mL的EP管中，50 ℃氮氣流下吹干，干燥后樣品加入50 μL流動相復溶，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣，進行HPLC分析，測定小鼠淋巴結中SN-38(A)的含量。

2.3.5 腳掌樣品的處理方法

取小鼠腳掌，稱質量，按腳掌質量的5倍量加入生理鹽水勻漿。精密移取腳掌勻漿樣品50 μL，置于1.5 mL離心試管中，加入喜樹堿內標液50 μL，渦旋30 s，加入含體積分數(shù)0.5%乙酸的乙腈溶液150 μL，旋渦1 min，于16 000 r·min-1離心10 min。小心吸取上清液至另一干凈的1.5 mL的EP管中，50 ℃氮氣流下吹干，干燥后樣品加入50 μL流動相復溶，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣，進行HPLC分析，測定小鼠腳掌中殘留的SN-38(A)的含量。

2.3.6 方法專屬性試驗

取小鼠空白血漿、空白淋巴結和空白腳掌，除不加內標溶液外，其余按“2.3.3～2.3.5”條方法處理并分析，獲得空白樣品的色譜圖；將一定質量濃度的SN-38標準溶液和內標溶液加入小鼠空白血漿及組織中，同法操作，獲得相應的色譜圖；同法得到小鼠給藥后血漿、淋巴結及腳掌樣品色譜圖（圖2）。結果表明，組織中內源性物質不干擾SN-38的測定。

圖2 SN-38在小鼠血漿、淋巴結及腳掌中的液相色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of SN-38 in mice plasma, lymph nodes and limb soles

2.3.7 標準曲線的繪制

取干凈的1.5 mL EP管，精密吸取SN-38系列標準溶液，37 ℃氮氣流下吹干，分別加入小鼠空白血漿、空白淋巴結勻漿液和空白腳掌勻漿液各50 μL，配置成相當于SN-38質量濃度為25、50、100、1 000、2 500和5 000 μg·L-1的標準樣品，按“血漿及組織樣品處理方法”項下操作，進樣20 μL，記錄色譜圖。以SN-38的質量濃度為橫坐標，以藥物樣品峰面積與內標物樣品峰面積之比（AS/AI）為縱坐標，用加權最小二乘法進行回歸計算，求得線性回歸方程。SN-38在小鼠血漿、淋巴結、腳掌中的標準曲線方程見表2。

表 2 SN-38(A)在血漿、淋巴結及腳掌的液相方法標準曲線Table 2 Calibration curves of SN-38(A) for plasma, lymph nodes and limb soles by HPLC method

2.3.8 提取回收率

用空白生物樣品按“2.3.7”條方法配制含SN-38低、中、高3個質量濃度（分別為25、100、5 000 μg·L-1）的質量控制（QC）樣本，每一個質量濃度各5樣本，以處理后SN-38的峰面積除以未經提取相應質量濃度的SN-38的峰面積，即為SN-38的提取回收率。內標提取回收率方法同上，SN-38提取回收率結果見表3。

由試驗結果可知，SN-38與內標的提取回收率均大于50%，且提取回收率比較穩(wěn)定，說明該方法適合SN-38的體內提取。

2.3.9 精密度與準確度

取小鼠空白血漿、空白淋巴結勻漿液和空白腳掌勻漿液各50 μL，按“2.3.7” 條方法配制含SN-38低、中、高3個質量濃度的質量控制（QC）樣本，每一質量濃度5樣本，各3批，連續(xù)測定3 d，與標準曲線同時進行。計算QC樣品的日間和日內相對標準偏差，結果見表4。

2.3.10 SN-38在血漿中穩(wěn)定性的研究

考察了血漿樣品室溫放置8 h、血漿樣品經歷3次凍融循環(huán)、血漿樣品?20 ℃放置7 d、血漿樣品經處理后4 ℃放置12 h的穩(wěn)定性。精密吸取小鼠血漿50 μL，按“2.3.7”條方法制備SN-38低、中、高3個質量濃度（分別為25、100、5 000 μg·L-1）的質量控制（QC）樣品，每一質量濃度5樣本分析，按照“2.3.3”條方法操作，測得樣品質量濃度。SN-38在小鼠空白血漿中的穩(wěn)定性結果見表5。

表4 SN-38(A)測定的精密度與準確度Table 4 Precision and accuracy of method for determination of SN-38(A)

表5 SN-38(A)在小鼠血漿中不同貯存條件下的穩(wěn)定性(n=5)Table 5 Stability of SN-38(A) at different storage conditions in mice plasma (n=5)

結果表明，SN-38在以上條件下均可穩(wěn)定存在，而在實際試驗的過程中血漿樣品取出后均被立即放入冰箱中貯存、待處理及分析。

2.4 不同相對分子質量PEG溶解SN-38對其淋巴攝取量實驗

2.4.1 溶液配制

精密稱取SN-38原料藥10 mg共 4份置于4個10 mL量瓶中，分別加入乙醇、PEG200、PEG400和PEG800 5 mL后加適量乙醇溶解，用乙醇稀釋至刻度，得到質量濃度為1 g·L-1的SN-38溶液劑。

2.4.2 小鼠給藥方案及樣品采集

取昆明種小鼠72只，分成4組，分別為乙醇組、PEG200組、PEG400組、PEG800組，每組18只，小鼠給藥前自由飲食飲水，從小鼠的右后腳墊皮下分別注射“2.1”條配制的SN-38溶液劑20 μL，使每組每個時間點都有3只小鼠。給藥后于30 min、1 h、2 h、4 h、8 h和12 h眼眶取血于肝素抗凝管中，8 000 r·min-1離心10 min分離血漿。立即置冰箱（-20 ℃）保存待測。將取血后的小鼠斷頸處死，迅速取出小鼠右腘淋巴結和右后腳掌，用生理鹽水沖洗表面血液及內容物后，裝入自封袋，于-20 ℃保存至分析測定。

2.4.3 試驗結果與數(shù)據(jù)處理

2.4.3 .1 血漿中的藥物濃度測定

按照“2.3.3”條方法處理血漿樣品，取上清液20 μL進樣，進行HPLC分析，將所得峰面積帶入血漿標曲計算血漿中SN-38(A)的質量濃度，測定給藥后不同時間點小鼠血漿中SN-38(A)的含量，結果見圖3。

圖3 皮下注射1 mg·kg-1SN-38血漿中SN-38(A)的質量濃度Fig. 3 SN-38(A) concentration in plasma after subcutaneous administration at the dose of 1 mg·kg-1. The data arepresented as threemean value ± S.D.

采用統(tǒng)計矩模型進行數(shù)據(jù)的處理，結果見表6。

表 6 皮下給藥劑量1 mg·kg-1 SN-38(A)在血漿中的藥動學參數(shù)Table 6 Pharmacokinetic parameters of SN-38(A) in plasma after subcutaneous administration at the dose of1 mg·kg-1

由圖3和表6可知，皮下注射后會有少量藥物入血，其中乙醇組和PEG800組中SN-38的量顯著高于其他組，血漿中SN-38在PEG800中的達峰時間顯著長于其他組，分析可能的原因是由于PEG800相對分子質量大，其黏度大，延緩了藥物進入血液循環(huán)的時間。

2.4.3 .2 腘淋巴結中SN-38含量的測定

按照“2.3.4”條方法處理淋巴結，取上清液20 μL進樣，進行HPLC分析，將所得峰面積帶入標準曲線計算SN-38(A)在淋巴結內的質量濃度，測定給藥后不同時間點小鼠腘淋巴結勻漿液中的SN-38(A)的含量，結果見圖4。

圖 4 皮下給藥劑量1 mg·kg-1 SN-38(A)在前哨淋巴結中的濃度Fig. 4 SN-38(A) concentration in popliteal lymph nodes after subcutaneous administration at the dose of 1 mg·kg-1.The data are presented as the mean value ± S.D.

采用統(tǒng)計矩模型進行數(shù)據(jù)的處理，結果見表7。

表 7 皮下給藥劑量1 mg·kg-1SN-38(A)在前哨淋巴結中的藥動學參數(shù)Table 7 Pharmacokinetic parameters of SN-38(A) in popliteal lymph nodes after subcutaneous administration at thedose of 1 mg·kg-1

由圖4和表 7可知，PEG組的藥時曲線下面積均高于乙醇組，PEG組SN-38在淋巴結中的分布均好于乙醇組，藥時曲線下面積大小順序為PEG200＞PEG400＞PEG800＞乙醇，隨著PEG相對分子質量增大，AUC減??；由表7可知，相比于乙醇組，PEG組顯著延長了SN-38的隨著PEG相對分子質量增大，SN-38在淋巴結中的減小，但均長于乙醇組。由此可以得知，PEG不僅增加了SN-38的淋巴攝取量，還延長了SN-38在小鼠淋巴結中的生物半衰期，并且這種延長作用隨著PEG的相對分子質量增大而減弱。

2.4.3 .3 注射部位的藥物殘留

注射部位殘留結果見圖5，由結果可知，乙醇組的藥物殘留量最多，顯著高于PEG組，藥物殘留量大小順序為乙醇＞PEG400＞PEG200＞ PEG800。

圖 5 皮下給藥劑量1 mg·kg-1注射部位殘留的SN-38(A)的含量Fig. 5 SN-38(A) remaining at the injection site after subcutaneous administration at the dose of 1 mg·kg-1. The dataare presented as mean values ± S.D.

3 討論

a．SN-38在不同相對分子質量PEG中的體外穩(wěn)定性實驗中，雖然用不同相對分子質量的PEG定容到同一刻度，但是由于PEG的相對分子質量不同，其黏度不同，磁力攪拌后，液面會有所變化，導致最終測得的SN-38A和SN-38I的總和不同，因此，采用SN-38A的質量濃度比SN-38A和SN-38I質量濃度的加和計算SN-38A所占比例。

b．淋巴結、腳掌及血漿中SN-38的測定只測定SN-38(A)是因為體內樣品的內源性物質會干擾SN-38（I）的測定，使測定結果不準確，因此，只比較SN-38(A)在淋巴結、血漿及腳掌中的含量。

c．淋巴結中SN-38(A)的AUC大小為PEG200＞PEG400＞PEG800＞乙醇，但是腳掌中PEG200和PEG400組的SN-38(A)的滯留量比PEG800多的原因可能是因為PEG800組的藥物進入血液循環(huán)的量較多，而PEG200與PEG400組中的藥物進入血液循環(huán)的量較少，故腳掌殘留量PEG800組比PEG200和PEG400組少。

d．血漿中SN-38(A)的含量測定結果，PEG800組在12 h時SN-38達到峰濃度，而其他3組都是在2 h時達到峰濃度的原因是PEG800的相對分子質量較大，其黏度也較大，因此，其進入血液循環(huán)的達峰時間也相對較晚，延緩了SN-38進入血液循環(huán)的時間。

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In vitro stability and the effects of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin dissolving in poly(ethylene glycol) on lymphatic uptake in mice

YIN Xiao-jing1, LIAO Xu2, ZHANG Yu1, HE Rui3, WANG Shu-jun3*
(1. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China; 2. Shenyang Newtiger Pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shenyang 110034, China; 3. School of Pharmacy, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China)

ObjectiveTo study the effect of different molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) on in vitro stability of 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin(SN-38) and lymphatic uptake in mice after subcutaneous administration. Methods To investigate the stability in vitro, after addition of ethanol, PEG200, PEG400, PEG800 to saturated solution of SN-38 in pH 7.4 PBS individually, the solutions were maintained at 37 ℃in waterbath for 12 h, then the concentration of SN-38 was determined with HPLC；for the in vivo study, SN-38 was dissolved in ethanol and ethanol solution containing 50% PEG200-800 with the concentration of 1 g·L-1, respectively. The above SN-38 solutions were administrated into the right soles of mice subcutaneously at the dose of 1 mg·kg-1. Then, the concentrations of SN-38 at different time points were detected with HPLC. Results The stability study show that the concentrations of SN-38 in different PEG solutions were in the order of PEG200＞PEG400＞PEG800＞ethanol, and the concentrations of SN-38 in the popliteal lymph nodes of mice for different solutions were in accordance with the result in vitro. Conclusion PEG can stabilize the lactone ring of SN-38 and enhance the lymphatic uptake of SN-38.

pharmaceutics; 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin; poly(ethylene glycol); subcutaneously administration；stability of the lactone ring; lymphatic uptake

R 94

A

（2014）02–0062–11

(本篇責任編輯：馬麗麗)

2014–01–02

銀曉晶(1988-)，女(漢族)，遼寧沈陽人，碩士研究生，E-mail 245560433@qq.com；*通訊作者：王淑君(1972-)，女(漢族)，浙江舟山人，教授，博士，主要從事藥物制劑研究，Tel. 024–23986360，E-mail 1252116911@qq.com。