張文君，吳 凡，王 鑫，譚亞楠，李 藝，陳立江

（遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化藤黃酸納米混懸劑處方

張文君，吳 凡，王 鑫，譚亞楠，李 藝，陳立江*

（遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036）

目的制備藤黃酸納米混懸劑，并對(duì)處方及制備工藝進(jìn)行優(yōu)化。方法 采用高壓均質(zhì)法制備藤黃酸納米混懸劑，以粒徑、多分散系數(shù)、zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化藤黃酸納米混懸劑的處方，并對(duì)處方進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)對(duì)制得的藤黃酸納米混懸劑進(jìn)行表征。結(jié)果 對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合，用效應(yīng)面法預(yù)測(cè)最佳處方。最優(yōu)處方下制備得到的藤黃酸納米混懸液粒徑為258.7 nm，多分散系數(shù)為0.186，平均zeta電位為-28.9 mV。結(jié)論 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法適用于藤黃酸納米混懸劑的處方優(yōu)化，且優(yōu)化所得處方具有良好的預(yù)測(cè)性。

藥劑學(xué)；星點(diǎn)設(shè)計(jì)；藤黃酸；納米混懸劑；高壓均質(zhì)

藤黃是藤黃科植物藤黃( Garcinia hanburyi Hook．f．) 樹(shù)干經(jīng)切傷后所分泌的干燥樹(shù)脂。而藤黃酸（gambogic acid, GA）為藤黃的主要有效成分，具有顯著的抗腫瘤活性[1-4]，但水溶性差限制了其應(yīng)用。納米混懸劑(nanosuspensions, NS)是純藥物納米顆粒的亞微細(xì)粒膠態(tài)分散體，以微量的表面活性劑為助懸劑，通過(guò)勻化、濕磨等方法制備[5-6]，主要應(yīng)用于溶解度差的藥物[7-8]。本研究作者采用高壓均質(zhì)法將藤黃酸制成納米混懸劑，并采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，以期得到處方簡(jiǎn)單、工藝穩(wěn)定、重現(xiàn)性及預(yù)測(cè)性良好的藤黃酸納米混懸劑。

1 儀器與材料

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義英峪予華儀器廠），KQ5200DB數(shù)控超聲波清洗器、Nano-ZS納米粒度及zeta電位分析儀(英國(guó)Malvern儀器公司)，RE5299旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），110L高壓均質(zhì)機(jī)（美國(guó)Mfic公司）。

藤黃酸（實(shí)驗(yàn)室自制），pluronic F68（美國(guó)Sigma公司），卵磷脂（供注射用，PC ≥90%，上海太偉藥業(yè)有限公司，批號(hào)20110704），無(wú)水乙醇（天津富宇精細(xì)化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 制備方法

稱取藤黃酸溶于無(wú)水乙醇中，在低溫（0～3 ℃）攪拌下（3 000 r·min-1）緩慢注入含pluronic F68、卵磷脂的水溶液中，使其分散均勻，滴加完畢，旋除乙醇，得粗混懸劑。將所得粗混懸劑于3.21×103Pa壓力下均質(zhì)2次，8.03×107Pa壓力下均質(zhì)12次，即得藤黃酸納米混懸液。

2.2 單因素考察

2.2.1 均質(zhì)壓力對(duì)粒徑的影響

按“2.1”條方法制備藤黃酸粗混懸劑，所得粗混懸劑于3.21×103Pa均質(zhì)2次，分別于4.82×107Pa、6.43×107Pa、8.03×107Pa、9.64×107Pa、1.12×108Pa、1.29×108Pa壓力下均質(zhì)12次，采用激光粒度分布儀對(duì)所得納米晶的粒徑進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)均質(zhì)壓力為8.03×107Pa時(shí)，所制備的藤黃酸納米混懸劑具有最小粒徑。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖 1 高壓均質(zhì)壓力對(duì)粒徑的影響（n=3）Fig. 1 The effect of homogenization pressure on particle size (n=3)

2.2.2 均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑的影響

按“2.1”條方法制備藤黃酸粗混懸劑，所得粗混懸劑于8.03×107Pa壓力下分別均質(zhì)2、4、8、12、18和24次取樣，采用激光粒度分布儀對(duì)所得納米晶的粒徑進(jìn)行考察。結(jié)果表明，當(dāng)均質(zhì)次數(shù)為12次時(shí)，所制備的藤黃酸納米混懸劑具有最小粒徑。結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖 2 高壓均質(zhì)次數(shù)對(duì)粒徑的影響 (n=3)Fig. 2 The effect of high pressure homogenization on particle size (n=3)

2.2.3 無(wú)水乙醇用量的考察

稱取藤黃酸分別溶于1、5和10 mL無(wú)水乙醇中，按“2.1”條方法制備藤黃酸納米混懸劑。采用激光粒度分布儀對(duì)所得納米晶的粒徑進(jìn)行考察。結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 藤黃酸在無(wú)水乙醇中的濃度對(duì)納米混懸液粒徑的影響（n=3）Table 1 The effect of concentration of GA in absolute ethyl alcohol on particle size(n=3)

結(jié)果顯示，無(wú)水乙醇用量對(duì)納米混懸液的粒徑有一定影響，且隨無(wú)水乙醇用量的增加，納米混懸液的粒徑減小。因有機(jī)溶劑具有一定毒性，最終選擇加入無(wú)水乙醇1 mL。

2.3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化處方

2.3.1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定影響藤黃酸納米混懸劑處方的主要因素，并在此基礎(chǔ)上，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)3個(gè)顯著的影響因素做進(jìn)一步的優(yōu)化。以卵磷脂（X1）、伯洛沙姆（X2）及藤黃酸（X3）的質(zhì)量作為考察因素，以粒徑、多分散系數(shù)、zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用三因素、五水平的星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對(duì)藤黃酸納米混懸劑的處方進(jìn)行優(yōu)化，因素水平設(shè)計(jì)表見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表 2 因素水平設(shè)計(jì)表Table 2 Variables and levels in the central composite experimental design

表 3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of central composite design experiments

Continued table 3

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，以三因素（X1、X2、X3）作為自變量，粒徑、多分散系數(shù)、zeta電位為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Design Expert 8.0.6軟件，分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性及二項(xiàng)式擬合，結(jié)果顯示，二項(xiàng)式方程擬合較好且其置信度明顯優(yōu)于多元線性方程。所得二項(xiàng)式方程如下：

2.3.2 效應(yīng)面優(yōu)化

各效應(yīng)值的效應(yīng)面曲線顯示了分別對(duì)各指標(biāo)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3～5。

由圖3～5可見(jiàn)，在一定范圍內(nèi)Y1、Y3隨X1、X2的增大呈上升趨勢(shì)，隨X3的增大而呈下降趨勢(shì)；Y2隨X1、X2、X3的增大呈上升趨勢(shì)。Y1與制劑體系的分布均勻程度有關(guān)，因此，在一定范圍內(nèi)，Y1越小說(shuō)明其分散性越好；Y2及Y3分別體現(xiàn)了制劑中粒徑的分布情況和制劑的穩(wěn)定性，Y3的絕對(duì)值越大，表明該體系具有較好的穩(wěn)定性，Y2在一定范圍內(nèi)優(yōu)先選擇粒徑較小的制劑處方，經(jīng)過(guò)Design Expert 8.0.6對(duì)處方進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳處方。即藤黃酸納米混懸液中，波洛沙姆質(zhì)量濃度為0.6 g·L-1，卵磷脂質(zhì)量濃度為0.63 g·L-1，藤黃酸質(zhì)量濃度為0.75 g·L-1。

圖 3 多分散系數(shù)與X1、X2、X3效應(yīng)面三維圖和二維等高圖Fig. 3 Effect of X1、X2、X3 values on PDI with 3D surface plot and 2D contour plot

圖 4 粒徑與X1、X2、X3效應(yīng)面三維圖和二維等高圖Fig. 4 Effect of X1、X2、X3 values on size with 3D surface plot and 2D contour plot

圖 5 Z eta與X1、X2、X3效應(yīng)面三維圖和二維等高圖Fig. 5 Effect of X1、X2、X3 values on zeta with 3D surface plot and 2D contour plot

2.4 最優(yōu)處方驗(yàn)證

按照以上優(yōu)化所得處方工藝，制備3批藤黃酸納米混懸液，并對(duì)實(shí)際的多分散系數(shù)、粒徑及zeta電位進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。

表 4 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面優(yōu)化法的驗(yàn)證(n=3，?±s )Table 4 Verification of the central composite design and response surface method(n=3，?±s )

由表4可見(jiàn)，各指標(biāo)的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的偏差均較小，說(shuō)明采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法所得到的數(shù)學(xué)模型可以較好地描述各因素與指標(biāo)間的關(guān)系，預(yù)測(cè)性好，適用于藤黃酸納米混懸劑的處方優(yōu)化。

2.5 藤黃酸納米混懸劑的表征

取適量藤黃酸納米混懸液，將其稀釋至適當(dāng)濃度，滴1滴于密封膜上，將銅網(wǎng)帶有碳膜的一面接觸樣品液體后，用鑷子小心地將銅網(wǎng)夾起，用小濾紙片吸去銅網(wǎng)邊緣處多余的溶液，用鑷子輕輕取下，拭去邊緣處多余溶液，在白熾燈下烤干后在透射電鏡下觀察。圖6為藤黃酸納米凍干粉在透射電鏡下觀察到的微觀形態(tài)，藥物在混懸劑中呈現(xiàn)球形粒子分布，且粒徑較為均一。

圖 6 藤黃酸納米混懸劑掃描電鏡圖Fig. 6 Transmission electron microscop image of gambogic acid nanosuspensions

3 結(jié)論

通過(guò)試驗(yàn)，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)的方法，優(yōu)選出藤黃酸納米混懸劑的最佳處方。以卵磷脂及波洛沙姆為穩(wěn)定劑，采用高壓均質(zhì)法制備藤黃酸納米混懸劑，粒徑為258.7 nm，多分散系數(shù)為0.186，平均zeta電位為-28.9 mV。

4 討論

目前，藥劑處方優(yōu)化時(shí)多采用正交設(shè)計(jì)及均勻設(shè)計(jì)，兩者皆為基于線性模型的設(shè)計(jì)。而大多數(shù)情況下，各因素間存在交互作用而對(duì)效應(yīng)的影響并非線性。因此，線性模型具有精度不夠、預(yù)測(cè)性較差等缺陷[9]。效應(yīng)面優(yōu)化法為一循序漸進(jìn)的方法，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定因素水平的極大值和極小值，再根據(jù)效應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法確定其他幾個(gè)水平，更具科學(xué)性。因其實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、并可進(jìn)行線性或非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，已在制劑工藝及處方篩選優(yōu)化中得到了一定范圍的應(yīng)用[10]。

本試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化藤黃酸納米混懸劑的處方，建立了二項(xiàng)式模型并繪制效應(yīng)面圖，通化效應(yīng)面曲線的優(yōu)化及軟件處理，得到最優(yōu)處方，所制備的納米混懸劑粒徑與預(yù)測(cè)值接近，藤黃酸納米混懸劑分散均勻度好，為其進(jìn)一步研究奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] LIU Wei, GUO Qing-long, YOU Qi-dong, et al. Anticancer effect and apoptosis induction of gambogic acid in human gastric cancer line BGC-823 [J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(24): 3655-3659.

[2] GUO Qing-long, YOU Qi-dong, WU Zhao-qiu, et al. General gambogic acids inhibited growth of human hepatoma SMMC-7721 cells in vitro and in nude mice [J]. Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(6): 769-774.

[3] 張洪明, 朱曉莉, 陳保安, 等. 藤黃酸誘導(dǎo)SPC-A-1 肺腺癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的探討 [J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志, 2009, 13(2): 44-47.

[4] 晏烽根, 李慶林. 新藤黃酸誘導(dǎo)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-1凋亡以及對(duì)p-p38 和p-ERK1/2 蛋白的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2011, 27(3): 355-359.

[5] LI Xue-ming, LI Gu, XU Yuan-long, et al. Preparation of fenofibrate nanosuspension and study of its pharmacokinetic behavior in rats[J]. Drug Dev Ind Pharm, 2009, 35(7): 827-833.

[6] DENG Jie-xin, HUANG Leaf, LIU Feng. Understanding the structure and stability of paclitaxel nanocrystals[J]. Int J Pharm, 2010, 390(2): 242-249.

[7] SARNES A, STERGAARD J, JENSEN S S, et al. Dissolution study of nanocrystal powders of a poorly soluble drug by UV imaging and channel fl ow methods[J]. Eur J Pharm Sci, 2013(50): 511-519.

[8] GAO Lei, LIU Gui-yang, MA Jian-li, et al. Application of drug nanocrystal technologies on oral drug delivery of poorly soluble drugs[J]. Pharm Res, 2013 (30): 307-324.

[9] 陳海亭，尹蓉莉，陳金玉, 等. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化山楂葉總黃酮微孔滲透泵控釋片處方[J]. 中成藥, 2011, 33(10): 1688-1692.

[10] 劉艷杰, 項(xiàng)榮武. 星點(diǎn)設(shè)計(jì)效應(yīng)面法在藥學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志, 2007, 24(6): 455-457.

Abstract: ObjectiveTo optimize the formulation and preparation technology of gambogic acid nanosuspensions. Method The nanosuspensions were prepared by high pressure homogenization. The formulation was optimized by the central composite design-response surface methodology with repect to size, PDI and zeta potential, and the optimal formulation was verified. Result Gambogic acid nanosuspensions were prepared under the optimal condition. Under this condition, size, PDI and zeta were 258.7 nm, 0.186 and -28.9 mV, respectively. Conclusion The nanosuspensions optimized by design-response surface methodology have a reliable predictability.

Optimization of the formulation of Gambogicacid nanosuspensions by the central composite design-response surface methodology

ZHANG Wen-jun, WU Fan, WANG Xin, TAN Ya-nan, LI Yi, CHEN Li-jiang*
(School of Pharmacy, Liaoning University, Shenyang 110036, China)

pharmaceutics; central composite design; gambogic acid; nanosuspensions; high pressure homogenization

R 94

A

（2014）02–0043–10

(本篇責(zé)任編輯：馬麗麗)

2014–01–09

遼寧“百千萬(wàn)人才工程”資助項(xiàng)目(2012921024)；遼寧大學(xué)“大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃”(201210140003)

張文君(1989-)，女(漢族)，四川萬(wàn)縣人，碩士研究生，E-mail jjll290@163.com；*通訊作者: 陳立江(1969-)，女(漢族)，湖南永州人，教授，碩士，主要從事藥物新劑型及新技術(shù)的研究，Tel. 024-62202469，E-mail chlj16@163.com。