劉建勛,林咸明

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不同時程電針預(yù)處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護(hù)效應(yīng)

劉建勛1,林咸明2

(1.寧波市第二醫(yī)院,寧波 315010;2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院,杭州 310053)

通過觀察不同時程電針預(yù)處理對腦缺血大鼠腦含水量及血腦屏障通透性的影響,評價電針預(yù)處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護(hù)效應(yīng)。將清潔級健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組(=48),模型對照組、電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組、電針預(yù)處理7 d組及電針預(yù)處理15 d組,電針預(yù)處理各組電針預(yù)處理結(jié)束后建立大鼠單側(cè)大腦中動脈阻塞(MCAO)模型,分別于腦缺血12 h、24 h和48 h,檢測腦含水量、血腦屏障EB透過量。模型對照組腦缺血12 h和48 h時間點(diǎn)大鼠腦含水量及血腦屏障EB透過量均低于腦缺血24 h時間點(diǎn)(＜0.05);電針預(yù)處理15 d組在腦缺血各時間點(diǎn)對腦含水量及EB透過量的減少作用顯著(＜0.05,＜0.01＜0.001)。腦缺血12 h、24 h、48 h3個時間點(diǎn)中以腦缺血24 h時間點(diǎn)血腦屏障損傷程度顯著;電針預(yù)處理可通過明顯降低腦缺血大鼠腦水腫及血腦屏障通透性發(fā)揮其對腦缺血大鼠血腦屏障功能的保護(hù)效應(yīng)。

電針;預(yù)處理;腦缺血;血腦屏障;大鼠

由于缺血性腦血管病的高發(fā)病率、高致死率、高致殘率,目前尚缺乏高效的治療手段,近年來,針對腦缺血損傷的腦保護(hù)研究層出不窮,其中預(yù)處理是非常重要的預(yù)防措施之一。由預(yù)處理產(chǎn)生的腦保護(hù)現(xiàn)象稱為“腦缺血耐受”。預(yù)處理的方式多種多樣,短暫腦缺血、遠(yuǎn)程缺血、低氧、高壓氧、麻醉劑及促炎性細(xì)胞因子等,但是其中很多預(yù)處理方式在臨床中有著不可操作性。國內(nèi)已有研究者發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理可誘導(dǎo)腦缺血耐受[1-4]。利用電針可誘導(dǎo)腦缺血耐受這一效應(yīng)及該療法的優(yōu)勢,開展對缺血性腦血管高危人群的預(yù)防性治療具有積極意義。血腦屏障(blood brain barrier, BBB)是腦組織與血管之間的維持各種物質(zhì)穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu),腦缺血損傷后血腦屏障破壞以及并發(fā)的腦水腫是缺血性腦血管病的主要病理損害。血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整性與腦水腫的形成密切相關(guān),要研究電針預(yù)處理對缺血性腦血管病的腦保護(hù)作用,解決血腦屏障受損的問題是防治缺血性腦血管疾病所致?lián)p傷的關(guān)鍵[5]。不同時程電針預(yù)處理對血腦屏障功能保護(hù)作用的研究未見報(bào)道,本研究的目的之一,就是尋求電針預(yù)處理對腦缺血大鼠血腦屏障功能保護(hù)作用的最佳電針預(yù)處理時程。

本實(shí)驗(yàn)對SD大鼠進(jìn)行不同時程電針預(yù)處理(預(yù)處理1 d、3 d、7 d、15 d),再參照Longa線栓法[6]建立大鼠單側(cè)MCAO模型,動態(tài)觀察不同時程電針預(yù)處理對血腦屏障功能(腦含水量、EB透過量)的影響,以揭示電針預(yù)處理對實(shí)驗(yàn)性腦缺血大鼠血腦屏障通透性的保護(hù)作用,并比較不同時程的電針預(yù)處理保護(hù)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選用清潔級健康雄性SD大鼠240只,體重(250±20)g,購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動物中心,飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。采用隨機(jī)數(shù)字表分配法將大鼠分為5組(=48),即模型對照組、電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組、電針預(yù)處理7 d組以及電針預(yù)處理15 d組。各電針預(yù)處理組進(jìn)行相應(yīng)時程的電針預(yù)處理后,各組大鼠建立單側(cè)MCAO模型,再將各組分成單側(cè)腦缺血12 h、24 h和48 h3個亞組,其中8只進(jìn)行腦含水量測定,另8只檢測伊文思藍(lán)透過量。

1.2 電針預(yù)處理方法

取百會、水溝(取穴點(diǎn)位置參照華興邦等制定的《實(shí)驗(yàn)動物穴位圖譜》),采用華佗牌0.20 mm×25 mm針灸針刺入穴位,連接HANS-100電針儀,頻率2/15 Hz,電流1 mA,每次30 min,每日1次。

1.3 單側(cè)MCAO模型建立方法

參照Longa線栓法[6]建立SD大鼠單側(cè)MCAO模型。術(shù)前24 h禁食、不禁水。用10%水合氯醛(0.35mL/100g體重)對大鼠進(jìn)行腹腔注射,完全麻醉后,固定,備皮,碘伏消毒,生理鹽水脫碘,垂直于目外眥與耳屏之間連線切口約1 cm,鈍性分離肌肉,暴露顳骨,置于激光多普勒血流監(jiān)測儀下監(jiān)測腦部即時基礎(chǔ)血流,再將大鼠取仰臥位固定,于頸前皮膚正中切口1.5 cm,暴露右側(cè)頸三角,分離右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA),在頸總動脈下端打一死結(jié)。游離頸外動脈主干,在其與頸內(nèi)動脈交接的根部用1號線打一死結(jié)。用縫合線阻斷左側(cè)頸總動脈并用止血鉗暫時阻斷頸內(nèi)動脈血流,在右側(cè)頸總動脈位于其與頸外動脈交接位置下端約2 mm處剪一約相當(dāng)于頸總動脈直徑1/4大小的切口,松開夾緊頸內(nèi)動脈的止血鉗,將制備好的栓線插入頸內(nèi)動脈(線栓為4號魚線,長約25 mm,預(yù)先蘸有肝素鈉),進(jìn)入頸內(nèi)動脈顱內(nèi)段,當(dāng)遇有輕微阻力時停止,同時用激光多普勒血流儀監(jiān)測缺血程度,以腦血流下降至基礎(chǔ)值的(45±10)%為MCAO大鼠模型缺血程度,栓子插入19～22 mm,栓線經(jīng)頸內(nèi)動脈與頸外動脈分叉輕插入顱內(nèi)至大腦前動脈(ACA),該深度恰好堵塞MCA開口,栓線外端留出約5 mm,90 min后進(jìn)行再灌注,將線栓抽至頸內(nèi)動脈起始部,即恢復(fù)MCA血供,用縫合線扎緊線栓后消毒、縫合皮膚,同時予青霉素鈉肌注。同步喂養(yǎng),取材。

1.4 腦含水量測定

腦含水量的測定參照Meng等[7]的方法。取造模后12 h、24 h、48 h共3個時間點(diǎn),麻醉大鼠,斷頭取腦,棄去小腦及雙側(cè)嗅球,稱取右側(cè)濕重(Wet weight,WW),恒溫烤箱110 ℃/24 h烘干后稱取干重(Dry Weight,DW)。干-濕比重法測定腦組織含水量,計(jì)算各組右側(cè)的腦組織含水量,計(jì)算公式為(WW－DW)/WW×100%。

1.5 腦缺血大鼠血腦屏障EB透過量的測定

血腦屏障通透性是按照Uyama O等的方法[8],通過滲出血管外的伊文思藍(lán)(EB)(Fluka進(jìn)口分裝)來評價的。在造模后12 h、24 h和48 h用10%水合氯醛麻醉大鼠(35 mg/100 g體重),經(jīng)股靜脈注入2% EB生理鹽水溶液(4 mL/kg),大鼠眼球結(jié)膜、四肢迅速藍(lán)染,表明EB注入成功。1 h后開胸通過左心室灌注生理鹽水),直到右心房流出的液體無色為止,斷頭取腦,取損傷側(cè)背外側(cè)新皮層,樣品稱重并置入50%三氯乙酸溶液中。勻漿和離心(10000 rpm,20 min),取上清液按1:3的比例用乙醇稀釋。熒光值通過多功能酶標(biāo)分析儀測得(激發(fā)波長620 nm,發(fā)射波長680 nm)。根據(jù)EB溶液(0～50 ng/mL)的外在標(biāo)準(zhǔn)繪出的EB與熒光值之間的線形標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以得出腦組織中EB的含量,并用每克組織含量來表示(ng/g)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間計(jì)量資料比較采用單因素方差分析();組間兩兩比較,方差齊性時用檢驗(yàn),方差不齊時用檢驗(yàn)。以＜0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 不同時程電針預(yù)處理對大鼠腦缺血不同時間點(diǎn)腦含水量的影響

從表1中可以看出,不同時程電針預(yù)處理大鼠在腦缺血12 h時間點(diǎn),各電針預(yù)處理組腦含水量明顯低于模型對照組(＜0.05),其中電針預(yù)處理15 d組與模型對照組比較,腦含水量降低最為明顯(＜0.001)。電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組和電針預(yù)處理7 d組之間無明顯差異(＞0.05),電針預(yù)處理15 d組大鼠腦含水量明顯低于電針預(yù)處理1 d、電針預(yù)處理3 d組(＜0.01),與電針預(yù)處理7 d組相比,電針預(yù)處理15 d組大鼠腦含水量亦有明顯降低(＜0.05);在腦缺血24 h時間點(diǎn),模型對照組、電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組和電針預(yù)處理7 d組大鼠腦含水量之間無明顯差異(＞0.05),電針預(yù)處理15 d組與模型對照組比較,大鼠腦含水量顯著下降(＜0.001),與電針預(yù)處理1 d組和電針預(yù)處理3 d組比較,大鼠腦含水量明顯下降(＜0.01),與電針預(yù)處理7 d組比較亦有明顯下降(＜0.05);在腦缺血48 h時間點(diǎn),各電針預(yù)處理組與模型對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中電針預(yù)處理1 d組和電針預(yù)處理7 d組大鼠腦含水量明顯低于模型對照組(＜0.01),電針預(yù)處理3 d組大鼠腦含水量明顯低于模型對照組(＜0.05),電針預(yù)處理15 d組與模型對照組比較,大鼠腦含水量顯著下降(＜0.001)。電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組和電針預(yù)處理7 d組大鼠腦含水量之間無明顯差異(＞0.05),電針預(yù)處理15 d組大鼠腦含水量明顯低于電針預(yù)處理1 d組與電針預(yù)處理7 d組(＜0.01),且明顯低于電針預(yù)處理3 d組(＜0.001)。

表1 不同時程電針預(yù)處理對腦缺血大鼠腦含水量的影響 (±s,100%)

注:與模型對照組比較1)＜0.05,2)＜0.01,3)＜0.001;與電針預(yù)處理1 d組比較4)＜0.01;與電針預(yù)處理3 d組比較5)＜0.01,6)＜0.001;與電針預(yù)處理7 d組比較7)＜0.05,8)＜0.01

2.2 不同時程電針預(yù)處理對腦缺血大鼠血腦屏障EB透過量的影響

如表2所示,在腦缺血12 h時間點(diǎn),各電針預(yù)處理組EB透過量明顯低于模型對照組,電針預(yù)處理1 d組和電針預(yù)處理3 d組與模型對照組比較差異明顯(＜0.01),電針預(yù)處理7 d組和電針預(yù)處理15 d組與模型對照組比較差異顯著(＜0.001)。電針預(yù)處理15 d組大鼠EB透過量明顯低于電針預(yù)處理1 d組與電針預(yù)處理3 d組,電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組、電針預(yù)處理7 d組之間EB透過量差異不明顯(＞0.05),電針預(yù)處理15 d組與電針預(yù)處理7 d組相比也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05);在腦缺血24 h時間點(diǎn),各電針預(yù)處理組大鼠EB透過量明顯低于模型對照組,電針預(yù)處理1 d組與模型對照組相比差異明顯(＜0.01),電針預(yù)處理3 d組、電針預(yù)處理7 d組和電針預(yù)處理15 d組與模型對照組相比差異顯著(＜0.001)。電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組和電針預(yù)處理7 d組之間EB透過量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(＞0.05)。電針預(yù)處理15 d組大鼠EB透過量明顯低于電針預(yù)處理1 d組,相比差異顯著(＜0.01),也明顯低于電針預(yù)處理3 d組、電針預(yù)處理7 d組(＜0.05);在腦缺血48 h時間點(diǎn),各電針預(yù)處理組EB透過量明顯低于模型對照組,電針預(yù)處理1 d組和電針預(yù)處理3 d組與模型對照組比較差異明顯(＜0.05),電針預(yù)處理7 d組與模型對照組比較差異顯著(＜0.01),電針預(yù)處理15 d組與模型對照組相比差異顯著(＜0.001)。電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組和電針預(yù)處理7 d組之間相比差異不明顯(＞0.05),電針預(yù)處理15 d組與電針預(yù)處理7 d組相比差異不明顯(＞0.05)。電針預(yù)處理15 d組大鼠EB透過量明顯低于電針預(yù)處理1 d組、電針預(yù)處理3 d組(＜0.05)。

表2 不同時程預(yù)處理對大鼠腦缺血不同時間點(diǎn)血腦屏障EB透過量的影響 (±s,ng/g)

注:與模型對照組比較1)＜0.05,2)＜0.01,3)＜0.001;與電針預(yù)處理1 d組比較4)＜0.01;與電針預(yù)處理3 d組比較5)＜0.05,6)＜0.01;與電針預(yù)處理7 d組比較7)＜0.05

3 討論

血腦屏障是存在于腦組織和血液之間,它通過控制血液循環(huán)中的某些物質(zhì)向中樞神經(jīng)組織轉(zhuǎn)運(yùn),從而保證中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定,其通透能力與中樞神經(jīng)的變性、損傷和炎癥等密切相關(guān)[9-10]。在生理狀態(tài)下,血腦屏障相對不通透,主要起屏障功能,嚴(yán)格控制水溶性物質(zhì)如小分子的電解質(zhì)進(jìn)入腦組織,只允許氣體分子和脂溶性的物質(zhì)通過血腦屏障彌散入腦組織。同時,為了維持腦部的營養(yǎng)供給,血腦屏障的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也使極性物質(zhì)進(jìn)出腦組織[11]。血腦屏障的通透性變化受腦細(xì)胞相關(guān)因素影響。許多調(diào)節(jié)因子可通過對內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和酶系統(tǒng)進(jìn)行影響,改變血腦屏障的通透性[12]。血腦屏障的功能遵循Starlin原理,即任何在單純靜水壓下進(jìn)入腦組織的水分,都將由被阻留在血管內(nèi)的電解質(zhì)和血漿蛋白形成的滲透壓所建立起的一種反向力量將其重新“抽”回血液,從而有效地控制水分子及其溶質(zhì)進(jìn)入腦組織[13]。在病理情況下,由于血腦屏障受到破壞,這種調(diào)控作用消失,血液的成分,包括電解質(zhì)和血漿蛋白因血液壓力而經(jīng)開放的血腦屏障釋入腦組織,即血腦屏障通透性增加。

缺血、缺氧是誘發(fā)腦水腫的主要原因,而血腦屏障通透性增加又是腦水腫加重的主要因素。缺血量的多少以及缺血時間的長短與腦損傷的程度有著極大的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,腦缺血后腦損傷呈拋物線狀發(fā)展趨勢,即在實(shí)驗(yàn)所選取的3個時間點(diǎn)中以腦缺血后24 h時間點(diǎn)損傷最為嚴(yán)重,在12 h和48 h時間點(diǎn)損傷呈發(fā)展到緩解的狀態(tài)?？赡芘c缺血后血腦屏障的自我修復(fù)有關(guān)。電針預(yù)處理可降低腦含水量及減少血腦屏障EB透過量,以電針預(yù)處理15 d組效果最為顯著,短時程的電針預(yù)處理對降低腦水腫及減少EB透過量有反復(fù)性和不穩(wěn)定性且與腦損傷程度呈負(fù)相關(guān),長時程的電針預(yù)處理效果明顯優(yōu)于短時程電針預(yù)處理?？偠灾?不同時程的電針預(yù)處理對血腦屏障功能的保護(hù)效應(yīng)存在差異,以電針預(yù)處理15 d的保護(hù)效應(yīng)最為明顯。

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Protecting Effects of Different Time-course Electroacupuncture Pretreatments on Blood-brain Barrier Function in Cerebral Ischemia Rats

1,2.

1.315010,; 2.310053,

To investigate the impactsof different time-course electroacupuncture pretreatments on brain water content and blood-brain barrier permeability and assess their protecting effects on blood-brain barrier function in cerebral ischemia rats.Clean-grade healthy male SD rats were randomly allocated to five groups (=48): model control group, and one-day, three-day, seven-day and fifteen-day electroacupuncture pretreatment groups. A rat model of unilateral middle cerebral artery occlusion (MCAO) was made after electroacupuncture pretreatment was finished in various electroacupuncture groups. The water content of the brain and the amount of EB through blood brain barrier were measured at 12, 24 and 48 hrs after cerebral ischemia.Both brain water content and EB permeation amount were lower at 12 and 48 hrs than at 24 hrs after cerebral ischemia (＜0.05). There was a significant reducing effect on brain water content and EB permeation amount in the fifteen-day electroacupuncture pretreatment group at various time points after cerebral ischemia (＜0.05,＜0.01,＜0.001).The blood-brain barrier is impaired most severely at 24 hrs of the three time points 12, 24 and 48 hrs after cerebral ischemia. Electroacupuncture pretreatment can produce a protecting effect on blood-brain barrier function in cerebral ischemia rats by markedly reducing cerebral edema and blood-brain barrier permeability.

Electroacupuncture; Pretreatment; Cerebral ischemia; Blood-brain barrier; Rats

1005-0957(2014)12-1169-04

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.12.1169

2014-03-20

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y2111260)

劉建勛(1983 - ),男,醫(yī)師,碩士

林咸明(1966 - ),男,教授,研究方向?yàn)獒樉闹委熌X源性疾病的基礎(chǔ)與臨床研究,Email:Linxianming66@126.com