連方,劉菲,帥振虹

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經(jīng)皮穴位電刺激對(duì)高齡婦女卵細(xì)胞質(zhì)量及Bcl-2、Bax的影響

連方1,劉菲2,帥振虹2

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院,濟(jì)南 250011;2.山東中醫(yī)藥大學(xué),濟(jì)南 250014)

觀察經(jīng)皮穴位電刺激對(duì)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期腎虛高齡婦女卵顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)及卵細(xì)胞質(zhì)量的影響。將66例因輸卵管因素行IVF-ET的腎虛高齡婦女隨機(jī)分為治療組(經(jīng)皮穴位電刺激治療)和對(duì)照組(偽針),每組33例。觀察兩組患者腎虛證候積分變化,HCG日單個(gè)卵雌激素(E2/卵泡數(shù))、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率的差異,并應(yīng)用蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)卵顆粒細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)。與對(duì)照組相比,治療組患者腎虛癥狀明顯改善(＜0.01),HCG日E2/卵泡數(shù)、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率明顯升高(＜0.05),Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增多(＜0.01),Bax蛋白表達(dá)明顯降低(＜0.01),獲卵數(shù)和臨床妊娠率無(wú)顯著差異(＞0.05)。Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)與IVF相關(guān)參數(shù)有明顯相關(guān)性(＜0.05)。經(jīng)皮穴位電刺激能改善高齡婦女腎虛癥狀,提高卵細(xì)胞及胚胎質(zhì)量,此作用可能與調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá),降低顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。

經(jīng)皮穴位電刺激;Bcl-2;Bax;卵細(xì)胞質(zhì)量;體外受精-胚胎移植

女性生育能力隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸下降,35歲以后妊娠機(jī)會(huì)顯著減少。在助孕技術(shù)中,高齡婦女卵細(xì)胞質(zhì)量下降成為制約其臨床妊娠率的關(guān)鍵因素。顆粒細(xì)胞通過(guò)縫隙連接,以自分泌和旁分泌的方式對(duì)卵細(xì)胞起營(yíng)養(yǎng)支持、信息傳遞等重要作用。Bcl-2、Bax蛋白為B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)家族成員,定位于線粒體膜,通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體膜電位和線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡,分別起抑制和促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡的作用[1]。本研究觀察經(jīng)皮穴位電刺激對(duì)行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)的腎虛型高齡不孕患者卵顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax表達(dá)及卵細(xì)胞質(zhì)量的影響,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象

66例患者來(lái)源于2013年3月至2013年9月山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合生殖與遺傳中心門(mén)診,隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組,每組33例。兩組患者年齡、病程、治療前腎虛證候積分、治療前基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),具有可比性。詳見(jiàn)表1-2。

表1 兩組患者一般資料比較 (±s)

表2 兩組患者治療前基礎(chǔ)內(nèi)分泌水平比較 (±s)

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)

符合樂(lè)杰主編《婦產(chǎn)科學(xué)》[2]中不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn);符合中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科專(zhuān)業(yè)委員會(huì)1990年第三屆學(xué)術(shù)會(huì)議修訂的“女性不孕癥的診療標(biāo)準(zhǔn)”[3]中輸卵管阻塞診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.2 腎虛中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)

主證為不孕,經(jīng)色淡黯,或者月經(jīng)遲發(fā),腰骶酸痛,脛膝酸軟或者足跟痛,舌質(zhì)淡黯,苔白,兩尺脈沉細(xì)或者沉細(xì)弱;兼證為頭暈耳鳴,小腹冷,夜尿多,性欲減退。以上主證必須具備,兼證具備1～2項(xiàng)即可以診斷。

中醫(yī)癥狀積分標(biāo)準(zhǔn)[4],根據(jù)癥狀程度(癥狀影響日常生活;癥狀明顯;輕度癥狀;正常)分別積分,主證腰骶酸痛記6、4、2、0分,其余癥狀記3、2、1、0分。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡在35～45歲之間;②符合西醫(yī)輸卵管阻塞性不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn);③符合中醫(yī)腎虛不孕癥辨證標(biāo)準(zhǔn);④簽署知情同意書(shū);⑤男方精液常規(guī)檢查正常。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①其他原因所致不孕癥;②基礎(chǔ)內(nèi)分泌FSH＞15mIU/mL者;③近3個(gè)月內(nèi)應(yīng)用激素類(lèi)藥物者;④子宮不具備妊娠功能或嚴(yán)重軀體疾病不能承受妊娠者;⑤患有嚴(yán)重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病者;⑥患有《母嬰保健法》規(guī)定的不宜生育的遺傳性疾病者;⑦具有吸毒等嚴(yán)重不良嗜好者;⑧接觸致畸量的射線、毒物、藥品并處于作用期者。

2 治療方法

2.1 治療組

采用促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a)長(zhǎng)方案超促排卵。促性腺激素(gonadotropin,Gn)啟動(dòng)日至應(yīng)用絨促性素(HCG)日給予經(jīng)皮穴位電刺激治療,將韓氏治療儀的電極貼片貼于相應(yīng)穴位上,關(guān)元、中極為一對(duì)正負(fù)極,雙側(cè)子宮、三陰交分別為一對(duì)正負(fù)極,強(qiáng)度以患者能耐受為度,持續(xù)30 min,隔日1次。常規(guī)取卵、體外受精、胚胎培養(yǎng)及移植。

2.2 對(duì)照組

采用GnRH-a長(zhǎng)方案超促排卵。偽針的使用時(shí)間和穴位與治療組相同,與患者交談分散患者注意力,使用偽針(將長(zhǎng)25 mm毫針剪去0.5寸,將斷面打磨圓滑,穿于一橡膠片上)于相應(yīng)穴位置模擬毫針刺法但不刺破表皮,僅使患者有點(diǎn)觸感,使其認(rèn)為毫針已刺入皮膚,用膠布固定橡膠片從而固定針身。常規(guī)取卵、體外受精、胚胎培養(yǎng)及移植。

3 治療效果

3.1 觀察指標(biāo)

3.1.1 腎虛證候積分

分別計(jì)算患者入組時(shí)和HCG日腎虛證候積分。

3.1.2 IVF相關(guān)參數(shù)

HCG日E2/卵泡數(shù)、獲卵數(shù)、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率、臨床妊娠率。卵細(xì)胞形態(tài)學(xué)(成熟度)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[5],Ⅲ級(jí)卵細(xì)胞為優(yōu)質(zhì)卵。胚胎按WIH評(píng)分系統(tǒng)[6],分?jǐn)?shù)≥7分為優(yōu)質(zhì)胚胎。胚胎移植(ET)后4～5星期做陰道B超檢查,見(jiàn)胎囊、胎芽反射及胎心者診斷為臨床妊娠。

3.1.3 顆粒細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

實(shí)驗(yàn)室回收卵母細(xì)胞后,留取卵泡液,提取顆粒細(xì)胞,進(jìn)一步純化后用Western blot法測(cè)定。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn);雙變量相關(guān)性分析采用相關(guān)分析。

3.3 治療結(jié)果

3.3.1 兩組患者腎虛證候積分比較

兩組患者HCG日腎虛證候積分及治療前后差值分別比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01),治療組在腎虛證候改善方面優(yōu)于對(duì)照組。詳見(jiàn)表3。

表3 兩組患者腎虛證候積分比較 (±s,分)

注:與對(duì)照組比較1)＜0.01

3.3.2 兩組臨床妊娠率比較

兩組患者臨床妊娠率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05),但治療組與對(duì)照組相比有增高趨勢(shì)。詳見(jiàn)表4。

表4 兩組臨床妊娠率比較 (n)

3.3.3 兩組患者IVF相關(guān)參數(shù)比較

與對(duì)照組相比,治療組HCG日E2/卵泡數(shù)、優(yōu)卵率、優(yōu)胚率均明顯升高(＜0.01),獲卵數(shù)無(wú)顯著差異(＞0.05),但治療組與對(duì)照組相比有增高趨勢(shì)。詳見(jiàn)表5。

3.3.4 兩組卵顆粒細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組相比,治療組患者卵顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(＜0.01),Bax蛋白表達(dá)顯著降低(＜0.01)。詳見(jiàn)表6、圖1。

組別nE2/卵泡數(shù)(pg/mL)獲卵數(shù)(個(gè))優(yōu)質(zhì)卵率(%)優(yōu)胚率(%)E2/卵泡數(shù)(pg/mL) 治療組33259.77±25.451)13.58±6.55 82.85±19.421) 59.63±15.301) 259.77±25.451) 對(duì)照組33235.59±26.4412.03±6.6757.79±16.4037.72±27.63235.59±26.44

組別nBcl-2/actinBax/actin 治療組330.67±0.161) 0.34±0.171) 對(duì)照組330.50±0.200.51±0.20

注:與對(duì)照組比較1)＜0.01

圖1 治療組(4、5)對(duì)照組(1、2、3)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

3.3.5 顆粒細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白與IVF相關(guān)參數(shù)相關(guān)性分析

兩組患者顆粒細(xì)胞Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)(=-0.980,＜0.01);Bcl-2蛋白與HCG日E2/卵泡數(shù)呈明顯正相關(guān)(=0.325,＜0.01),與獲卵數(shù)呈明顯正相關(guān)(=0.634,＜0.01),與優(yōu)卵率呈明顯正相關(guān)(=0.547,＜0.01),與優(yōu)胚率呈明顯正相關(guān)(=0.717,＜0.01);Bax蛋白與HCG日E2/卵泡數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)(=-0.270,＜0.05),與獲卵數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān)(=-0.653,＜0.01),與優(yōu)卵率呈明顯負(fù)相關(guān)(=-0.493,＜0.01),與優(yōu)胚率呈明顯負(fù)相關(guān)(=-0.694,＜0.01)。

4 討論

經(jīng)皮穴位電刺激是對(duì)傳統(tǒng)針刺治療的改良,克服了針刺入皮膚時(shí)的疼痛感,無(wú)創(chuàng)[7],減少了長(zhǎng)時(shí)間針刺造成的局部機(jī)械損傷,且刺激范圍大,操作方便,現(xiàn)亦被應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域。經(jīng)皮穴位電刺激可從整體上調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)分泌和卵巢局部微環(huán)境,提高卵巢低反應(yīng)患者臨床妊娠率[8],提高多囊卵巢綜合征患者卵泡液白血病抑制因子,改善其卵細(xì)胞和胚胎質(zhì)量[9]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎虛在女性生殖機(jī)能衰老的過(guò)程中起決定作用,腎臟精氣虛衰,天癸少而竭,則經(jīng)水無(wú)以行,卵細(xì)胞無(wú)以生,出現(xiàn)卵細(xì)胞發(fā)育不良、成熟延遲、萎縮及排出障礙等,導(dǎo)致高齡婦女生殖功能低下[10]。高齡不孕患者主要以腎精虛衰、沖任不固為基本特征,且使用外源性激素超促排卵,使多個(gè)卵泡生長(zhǎng)發(fā)育成熟并取出,過(guò)度耗竭腎中陰陽(yáng),更易加重腎虛癥狀。故以補(bǔ)腎益精、調(diào)理沖任為基本治法,取關(guān)元、中極為主穴,以補(bǔ)腎益精培元,以三陰交、子宮為配穴,以調(diào)理沖任氣血。諸穴并用,以期達(dá)到補(bǔ)腎益精、調(diào)理沖任的目的。

本研究顯示,治療組患者腎虛癥狀改善程度、IVF相關(guān)參數(shù)均優(yōu)于對(duì)照組,說(shuō)明經(jīng)皮穴位電刺激在改善高齡婦女腎虛癥狀、提高卵細(xì)胞及胚胎質(zhì)量方面有顯著效果。與對(duì)照組相比,治療組患者卵顆粒細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高,Bax蛋白表達(dá)明顯降低,且二者呈負(fù)相關(guān),作為影響顆粒細(xì)胞凋亡的因素,Bcl-2蛋白具有抑制顆粒細(xì)胞凋亡作用,Bax蛋白具有促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡作用[1],說(shuō)明經(jīng)皮穴位電刺激可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),降低顆粒細(xì)胞凋亡。研究顯示Bcl-2蛋白表達(dá)與IVF相關(guān)參數(shù)均呈明顯正相關(guān),Bax蛋白表達(dá)與IVF相關(guān)參數(shù)呈明顯負(fù)相關(guān),說(shuō)明卵顆粒細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)與卵細(xì)胞和胚胎質(zhì)量密切相關(guān),可有效預(yù)測(cè)卵細(xì)胞、胚胎質(zhì)量。綜上所述,經(jīng)皮穴位電刺激可以通過(guò)補(bǔ)腎益精、調(diào)理沖任,改善高齡婦女腎虛癥狀,提高卵細(xì)胞及胚胎質(zhì)量,此作用機(jī)理可能與調(diào)節(jié)卵顆粒細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá),降低顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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Effect of Transcutaneous Acupoint Electrical Stimulation on Oocyte and Bcl-2 and Bax in the Older Women

1,2,2.

1.250011,; 2.250014,

To observe the effect of transcutaneous acupoint electrical stimulation (TAES) on the ovarian granulosa cell apoptosis-related proteins, Bcl-2 and Bax, as well as the oocyte quality in the older women with kidney deficiency receiving in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET).Sixty-six older women with kidney deficiency who were receiving IVF-ET because of the fallopian tube factor were randomized into a treatment group (intervened by TAES) and a control group (intervened by sham acupuncture), 33 in each group. The kidney-deficiency syndrome score, HCG E2/follicle count per day, excellent follicle rate, excellent embryo rate, and clinical pregnancy rate were observed and compared between the two groups; Western blot was used to detect the expression of protein Bcl-2 and Bax.Compared to the control group, the treatment group had significant improvement in kidney-deficiency symptoms (＜0.01), significant increases in the HCG E/follicle count per day, excellent follicle rate, and excellent embryo rate (＜0.05), enhanced expression of Bcl-2 protein (＜0.01), and decreased expression of Bax protein (＜0.01); while there were no significant differences in comparing the retrieved oocyte number and clinical pregnancy rate (＞0.05). The expression of Bcl-2 and Bax proteins were markedly correlated with IVF-related indexes (＜0.05).TAES can improve the kidney-deficiency symptoms and the quality of oocyte and embryo in older women; this action is possibly related to the regulation of expression of the cell apoptosis-related protein Bcl-2 and Bax, as well as the decrease of granulose cell apoptosis.

Transcutaneous acupoint electrical stimulation; Bcl-2; Bax; Oocyte quality; In vitro fertilization-embryo transfer

1005-0957(2014)12-1097-03

R246.3

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2014.12.1097

2014-03-20

連方(1957 - ),女,主任醫(yī)師,博士