王洪陽 綜述 王秋菊 審校

耳聾是最常見的遺傳異質(zhì)性疾病之一，大多數(shù)遺傳性聾是單基因病。自1988年第一個耳聾基因被定位，1995年第一個非綜合征型耳聾基因POU3F4被克隆以來，耳聾基因的定位及克隆研究取得了巨大進展，目前已經(jīng)鑒定了76個非綜合征型耳聾相關基因，另外100多個已定位的耳聾基因座尚待相關基因的鑒定(截至2013年10月)[1]。在單基因病的致病基因定位和克隆研究中，通常采用的家系連鎖分析和定位克隆技術是最有效、最準確的方法之一，但是，如果家系中患病人數(shù)有限或不外顯，或外顯不全，或是散發(fā)性病例，則連鎖分析多半失效。此外，以Sanger測序為基礎的測序技術因其高成本和長耗時也限制了其應用。新一代測序技術(next-generation sequencing technology, NGS)為探索單基因病提供了新的途徑，因其無需收集大家系的樣本，且可對全外顯子組或全基因組的無偏倚測序，使得NGS在發(fā)現(xiàn)罕見遺傳病的病因方面具有獨特優(yōu)勢，尤其是對遺傳性聾患者的全外顯子組或耳聾相關基因組(分別占全基因組的1%和0.01%)[2]進行目標區(qū)域測序分析，捕獲的是疾病的大部分致病突變信息，具有所需樣本量少、費用低、通量高的優(yōu)勢，能夠檢測更多的樣本，促進了遺傳性聾新的致病變異的發(fā)現(xiàn)。本文聚焦于目標區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS在遺傳性聾基因研究中的應用，尤其是該技術在轉化醫(yī)學和新生兒聽力篩查中的應用前景，同時歸納了基因捕獲的主要方法和新一代測序技術的發(fā)展及其特點。

1 新一代測序技術

基因組是研究人類疾病的核心和基礎，基因組技術的進步徹底改變了鑒定人類基因突變的途徑。DNA測序技術發(fā)展的第一階段是以Sanger測序為基礎的第一代測序技術，2005年，Roche公司的454測序儀的出現(xiàn)標志著NGS問世，隨后，Illumina公司的Solexa測序儀和ABI公司的SOLiD測序儀相繼出現(xiàn)；不同的測序平臺在PCR模式、技術原理、測序模式及讀長等方面各有特點(圖1)，NGS也稱大規(guī)模平行測序或深度測序，其低成本及高通量并行測序的優(yōu)勢，使疾病的研究模式發(fā)生了重大轉變，但同時也具有文庫構建復雜、測序長度短和錯誤率偏高等缺點。為解決早期新一代測序技術的問題，最近幾年出現(xiàn)了幾種新的高通量測序技術，通過改變測序原理或檢測手段，實現(xiàn)了更加簡化的測序過程，更低的測序成本和更高的測序速度：如單分子測序，能夠直接觀察和測定DNA或RNA分子的數(shù)量和區(qū)域結構，主要包括HeliScope公司的遺傳分析系統(tǒng)、VisiGen公司的單分子合成測序、Pacific Biosciences公司的單分子實時測序技術以及Oxford納米孔測序技術等，這幾種新技術也被稱為第三代高通量測序技術(third-generation sequencing technology, TGS)[3]，三代測序技術各有其優(yōu)缺點，其特點比較見表1。

圖1 新一代測序平臺比較[3]

表1 第一～三代測序技術的特點比較

2 目標區(qū)域捕獲技術

2.1DNA水平的測序策略 目標區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS是利用定制的探針與基因組DNA進行雜交或PCR捕獲感興趣的基因組區(qū)域，然后應用高通量測序技術進行測序的策略，具有經(jīng)濟、精確、可行、周轉時間短等優(yōu)勢，能夠檢測更多的樣本。有文獻報道85%的人類致病突變位于占全基因組序列1%的蛋白質(zhì)編碼序列，即外顯子序列上[7]。針對基因組蛋白質(zhì)編碼區(qū)的全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)是介于全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association study, GWAS)與全基因組測序(whole genome sequencing, WGS)之間的基因分析策略[8]，利用目標區(qū)域捕獲將基因組的全部外顯子區(qū)域捕獲后進行高通量測序，以發(fā)現(xiàn)疾病相關遺傳變異，其本質(zhì)上也是一種目標區(qū)域測序技術，可以發(fā)現(xiàn)基因編碼區(qū)的低頻變異及對疾病具有不同效應的稀有變異。與全基因組測序相比，在相同成本下，目標區(qū)域測序技術可對更多個體的蛋白編碼信息進行研究，可獲得覆蓋度更深、準確性更高的數(shù)據(jù)。目標區(qū)域捕獲技術具有簡便、經(jīng)濟、高效的優(yōu)勢，可用于單基因病、復雜疾病及癌癥等的致病基因或易感基因的研究[9,10]。過去兩年中，WES已鑒定了1 000多種罕見單基因病的基因[10]。

2.2不同目標區(qū)域捕獲技術的比較 傳統(tǒng)的靶向富集技術是PCR和雜交，現(xiàn)今的靶向富集技術可以分為固相捕獲、液相捕獲、分子倒位探針(molecular inversion probes, MIP)和Spacer Multiplex Amplification Reac Tion(SMART)(表2)，其中固相捕獲及液相捕獲是以雜交為基礎的富集技術，而MIP和SMART是以PCR為基礎的非雜交富集技術，后兩者需要特殊的設備，不適用于高通量應用，因此只應用于特殊的基因測序；固相捕獲以芯片為載體，與設計的探針序列進行耦聯(lián)，進而對雜交后富集的DNA片段進行測序分析；液相捕獲原理與固相芯片捕獲相似，只是同探針進行耦聯(lián)的是微珠而非固相載體芯片。與固相芯片相比，液相捕獲具有成本低、操作簡便、所需DNA量少等優(yōu)勢[12]。

表2 常用靶向富集技術比較[11]

注：*CTR(capture target region)為目標捕獲區(qū)域

3 目標區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS在遺傳性聾研究中的應用

眾所周知，不同民族的耳聾基因突變頻率不同，目前多數(shù)耳聾基因研究局限于人類最常見的突變基因，以中國大陸人群為例，30%左右的遺傳性聾患者與GJB2、SLC26A4和線粒體12SrRNA突變有關，可通過常見的耳聾基因篩查明確診斷，而另外的70%左右的遺傳性聾卻無法明確病因，需要進行深度挖掘[13]。因為導致耳聾的大量致病基因以及復雜突變譜的存在，以基因特異性的Sanger測序作為遺傳性聾的基因診斷策略成本高、耗時長，且不同民族的常見基因突變不同也使其應用受限[2]。目標區(qū)域捕獲測序為耳聾基因研究提供了新的路徑，可在一次檢測中包含所有已知耳聾基因，檢測所有類型的突變，并可檢測傳統(tǒng)方法難以檢測的大基因，同時可應用于散發(fā)病例，是目前研究遺傳性聾的有效技術。2009年11月，Nature Genetics在線發(fā)表了首篇應用WES研究單基因病的論文，在3個家庭的4個米勒綜合征患者中篩選出致病基因DHODH[14]，首次證明了WES是快速定位單基因病致病基因的有效工具；此后，WES在單基因病研究中發(fā)揮了越來越多的重要作用，據(jù)估計WES可發(fā)現(xiàn)約60%單基因病的致病基因[15]。

3.1目標區(qū)域測序在遺傳性聾研究中的應用實例 目標區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測序途徑最近也鑒定出新的遺傳性聾基因，這些研究表明針對目標區(qū)域或全外顯子組的NGS，結合在非同源家系中驗證、功能和免疫標記檢測技術，可以在小家系中鑒定致病基因。最先應用這一策略的是Rehman等[16]，利用NimbleGen固相捕獲芯片技術，結合Roche 454測序儀鑒定了導致非綜合征型聾的致病基因C9orf75(之后重命名為TPRN)；首先捕獲了DFNB79位于染色體9q34.3(包含108個候選基因)的目標區(qū)域，然后對該2.9 Mbp的區(qū)域進行測序，在一個近親家系中患者的目標區(qū)域檢測到8個尚未報道的純合變異，其中6個是多態(tài)性表現(xiàn)，1個位于非編碼區(qū)，另外1個是位于所預測基因C9orf75上的一個無義突變；此后在針對DFNB79患者的檢測中發(fā)現(xiàn)了該基因的3個移碼突變，免疫標記也顯示小鼠耳蝸中TPRN編碼蛋白高表達。此后，特定區(qū)域捕獲或全外顯子組捕獲技術成功應用于多型耳聾分子基礎的研究(表3)。近兩年，目標區(qū)域捕獲聯(lián)合NGS開始應用于小規(guī)模人群研究，為建立耳聾分子流行病學數(shù)據(jù)庫及篩選熱點突變組合奠定了基礎；Shearer等[38]對100例非綜合征型遺傳性聾樣本進行捕獲測序，涵蓋了67個已知耳聾基因990個基因變異，診斷率為42%；楊濤等[39]對125個排除了常見致病突變的耳聾樣本進行捕獲測序，捕獲區(qū)域包括79個已知耳聾基因，最后在15個非常見基因上鑒定了28個致病突變，診斷率為17.4%。小規(guī)模人群研究一方面說明已知耳聾基因捕獲測序與常見耳聾基因篩查相比，提高了耳聾基因診斷率，另一方面也說明耳聾基因研究任重而道遠，仍有一半以上的遺傳性聾病因不明，有待進一步的研究。

表3 目標區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測序技術在聽力研究中的應用

3.2目標區(qū)域測序可行性的驗證 最近的一些研究從多方面驗證了NGS檢測遺傳性聾的可行性(表4)。Shearer等[12]評價了針對54個已知的非綜合征型耳聾基因進行靶向富集聯(lián)合新一代測序技術的可行性，目標基因的捕獲同時使用了固相捕獲和液相捕獲，并對Sureselect-Illumina和NimbleGen-454兩個平臺進行了比較，結果在6個特發(fā)性聾樣本中鑒定了5個致病突變，對目標區(qū)域測序在耳聾遺傳診斷方面的敏感度、特異度和可重復性給予了肯定。Brownstein等[25]應用的是包含246個耳聾相關基因的cRNA寡核苷酸探針(82個人類蛋白編碼基因，2個人miRNA和162個小鼠耳聾基因中人的同源基因)，從11個先證者的外周血中獲得配對末端庫，應用Illumina的NGS平臺進行測序，結果在6例先證者中發(fā)現(xiàn)了致病突變，分別位于CDH23、MYO15A、TECTA、TMC1和WFS1，并在另外的20例先證者及其家系中鑒定了致病等位基因；同時，他們發(fā)現(xiàn)了摩洛哥猶太人群中TMC1上的一個始祖等位基因突變，僅該隱性突變TMC1(p.S647P)就可解釋摩洛哥猶太人群中34%的遺傳性聾。在針對中國人的目標區(qū)域測序中，Wei等[40]設計了包含69個耳聾相關基因的芯片，該芯片首次加入了線粒體基因，然后對攜帶有5個已知突變的10個患者進行目標區(qū)域測序，驗證了該方法的可行性及應用價值，隨后在一個耳聾家系中鑒定了基因MYO7A上的復合雜合突變。盡管可行性多次得到驗證且碩果累累，但捕獲目標外顯子的高昂費用仍是限制NGS在人群中大規(guī)模應用的主要阻礙。新的捕獲測序策略不斷出現(xiàn)，例如Tang等[42]設計了一個cDNA探針來進行目標基因的富集以降低費用，Keulenaer等應用半自動PCR擴增聯(lián)合NGS，克服了以雜交為基礎的目標區(qū)域捕獲敏感性差的缺點[32]。

表4 近3年驗證NGS檢測耳聾基因診斷效用的文獻

3.3面臨的挑戰(zhàn) NGS途徑產(chǎn)生的突變結果仍需Sanger測序進行驗證，數(shù)據(jù)質(zhì)控缺乏管理監(jiān)督，數(shù)據(jù)分析及數(shù)據(jù)報道的無統(tǒng)一標準均限制了它的快速發(fā)展[45]。如何使不同的NGS平臺的數(shù)據(jù)標準化以便進行比較仍然懸而未決[46]，而因其測序時重復區(qū)域的堿基延伸的不可靠性而導致的錯誤率偏高問題亦亟待解決[47]，樣品準備和文庫構建尚待簡化，海量數(shù)據(jù)的分類、存檔、分析仍是難題。技術層面之外，倫理問題不容小視，從NGS海量數(shù)據(jù)中可以推測出許多屬個人隱私信息，甚至是親屬及相關民族的信息，盡管各單位倫理委員會對患者信息和數(shù)據(jù)的使用和儲存有嚴格的規(guī)定，目前仍缺乏對NGS數(shù)據(jù)使用管理的專一規(guī)則。此外，外顯子組測序技術的固有缺陷使其只能捕獲外顯子區(qū)域內(nèi)部和邊界的變異信息，對大部分發(fā)生在非編碼區(qū)的變異無能為力，且不能檢測到基因組內(nèi)較大的結構變異和基因拷貝數(shù)變化。

3.4應用前景 NGS的應用正在進入臨床實踐，臨床醫(yī)生有必要掌握醫(yī)學遺傳學的知識，以便更有效地進行疾病的診斷、治療、咨詢和預防。然而對數(shù)據(jù)的解釋分析及將探索結果轉化為臨床應用仍然充滿挑戰(zhàn)，目前最迫切的任務是從個人基因組上百萬的變異中篩選出致病突變。另一個很重要的方面是需同時提高遺傳咨詢能力，以解釋NGS產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)。不久的將來，臨床醫(yī)生有可能通過綜合分析既往史、家族史和NGS數(shù)據(jù)，鑒定有疾病傾向的變異以及個體中影響藥物代謝的變異，遺傳性疾病攜帶者也可能成為患者既往史的一部分。基因組學的發(fā)展很有可能最終導致遺傳醫(yī)學的誕生，推進人類健康的重大進步和發(fā)展[48]。

另一可能的應用方向是新生兒耳聾基因篩查。2000年我國開始在全國范圍內(nèi)開展新生兒聽力篩查工作，新生兒聽力篩查對耳聾的早期預防和干預意義重大，然而傳統(tǒng)的聽力篩查有假陽性率高、不能確定耳聾的潛在病因、不能發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性聾以及隨訪率低等缺點。大多數(shù)先天性和兒童早期發(fā)病的耳聾是基因突變導致的，耳聾遺傳信息對于疾病的診斷、治療及遺傳咨詢有重大意義。新生兒聽力與基因聯(lián)合篩查具有指導抗生素應用、指導部分耳聾患者減緩耳聾的發(fā)展、預測人工耳蝸植入的效果以及進行遺傳咨詢、評價再次生育子女出現(xiàn)耳聾的幾率等意義[49]。隨著目標區(qū)域捕獲和NGS的發(fā)展，可以通過一次實驗，檢測所有已知和候選的耳聾基因[25]，從而使具有高度遺傳異質(zhì)性耳聾的DNA診斷取得重大進展。

此外，隨著臨床轉化的逐步成熟，目標區(qū)域NGS還有望應用于高危人群的檢查、聾啞患者生育風險檢測及評估以利于優(yōu)生優(yōu)育。新一代測序平臺的高靈敏性，可對孕婦血漿中存在的微量胎兒DNA進行檢測，可針對包括遺傳性聾在內(nèi)的100種常見疾病的常見基因進行捕獲測序，實現(xiàn)無創(chuàng)性產(chǎn)前篩查及對遺傳性疾病的分析。

4 總結和展望

高通量及低成本的NGS極大地促進了遺傳性聾基因組學的研究進展，其中包括全外顯子組捕獲在內(nèi)的目標區(qū)域捕獲聯(lián)合新一代測序技術在遺傳性聾研究中具有廣泛的應用前景，作為全基因組測序的重要補充，研究者可以根據(jù)研究需要選擇合適的基因測序策略，從而更加經(jīng)濟高效地完成基因測序目的。然而，該技術的臨床應用仍然充滿挑戰(zhàn)，數(shù)據(jù)的分析管理等諸多問題有待解決，生物學信息的發(fā)展及管理制度的完善將有助于該技術更好地應用。此外，基因組水平研究是整個疾病研究的基礎，為了全面深入揭示遺傳性疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及遺傳特點，除基因組水平研究外，基于新一代測序技術的轉錄組、蛋白組及表觀組、宏基因組的系統(tǒng)研究是未來遺傳性疾病的研究趨勢，進而更好地為臨床篩查以及診治遺傳性疾病提供思路。

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