王永華 王一鳴 沈曉麗 韓明訓(xùn)

自由基作為機(jī)體新陳代謝的正常副產(chǎn)物，產(chǎn)生在體內(nèi)所有細(xì)胞中，并且可被各種防御體系滅活，使之維持在正常的水平。但是某些病理因素能導(dǎo)致自由基生成過(guò)多，從而對(duì)機(jī)體造成損傷。研究證明川芎(tetramethylpyrazine,TMP)能明顯增加豚鼠耳蝸血流，具有減輕慶大霉素(GM)的耳毒性作用[1，2]。因此本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)檢測(cè)慶大霉素致聾豚鼠耳蝸組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活力和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，結(jié)合聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測(cè)，觀察川芎對(duì)急性藥物性聾豚鼠耳蝸內(nèi)氧自由基生成的影響，以探討TMP對(duì)急性藥物性聾的干預(yù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 耳廓反射正常的健康豚鼠60只，體重250～350 g, 雌雄不限，隨機(jī)分成4組，正常對(duì)照組10只，TMP組10只，慶大霉素組(GM組)20只，GM+TMP組20只。所有動(dòng)物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。GM組每日腹腔注射硫酸慶大霉素120 mg/kg(天津藥業(yè)焦作有限公司，批號(hào)：06012122)；TMP組每日腹腔注射鹽酸川芎嗪40 mg/kg(北京市燕京制藥廠，批號(hào)：050701)；GM+TMP組同時(shí)注射硫酸慶大霉素和鹽酸川芎嗪，劑量分別同GM組和TMP組；正常對(duì)照組則每日腹腔注射等量生理鹽水。均連續(xù)用藥10天，每日一次，用藥期間每天監(jiān)測(cè)體重以調(diào)整藥量。

1.2ABR檢測(cè) 各組動(dòng)物于用藥前及停藥后第1天分別在隔音屏蔽室內(nèi)進(jìn)行ABR測(cè)試。豚鼠用戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉后，記錄電極置顱頂正中，參考電極及接地電極分別置于給聲耳及對(duì)側(cè)耳后乳突皮下。采用ZEP誘發(fā)電位儀(北京中科電器高技術(shù)公司)，帶通濾波為100～3 000 Hz，短聲(click)刺激，疊加512次，掃描時(shí)程10 ms，TDH-39型耳機(jī)輸出，重復(fù)率10次/秒，距離豚鼠耳道口0.5 cm，以能夠波Ⅲ的最小刺激聲強(qiáng)確定反應(yīng)閾。

1.3耳蝸組織MDA含量測(cè)定 各組豚鼠停藥后第一天完成ABR測(cè)試后，迅速斷頭處死取出聽泡，蝸?lái)敶檀?，雙側(cè)耳蝸合為一份標(biāo)本制成勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液-20 ℃凍存。采用南京建成生物研究所的MDA測(cè)定試劑盒，按說(shuō)明進(jìn)行操作。將實(shí)驗(yàn)試管中試劑及樣本用旋渦混勻器混勻，然后用保鮮薄膜將試管口扎緊，用針頭刺一小孔，95 ℃水浴40 分鐘，取出后流水冷卻，然后3 500～4 000 r/min，離心10分鐘，取上清，532 nm 處，1 cm光徑，蒸餾水調(diào)零，測(cè)各管吸光度值。計(jì)算MDA的含量，單位用nmol/mg prot表示。

1.4T-SOD、SOD1、SOD2活性檢測(cè) 動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)含有兩種SOD，即銅鋅-SOD(SOD1)與錳-SOD(SOD2)，兩者相加等于T-SOD，經(jīng)樣本前處理過(guò)的樣本中SOD2活力喪失，但SOD1活性不變。取耳蝸樣本稱重，以1 g：1 000 ml生理鹽水稀釋研磨，制成5%組織勻漿4 000轉(zhuǎn)離心15分鐘，取上清30 Ul,采用南京建成生物研究所的SOD測(cè)定試劑盒，按說(shuō)明書加入試劑，37 ℃恒溫水浴40分鐘后加入顯色劑，靜置10分鐘，用分光光度儀550 nm下測(cè)吸光度，計(jì)算各SOD含量，SOD活力單位用U/mg prot表示。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，自身前后ABR反應(yīng)閾比較應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)；組間比較采用單因素ANOVA分析，多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1各組豚鼠ABR反應(yīng)閾 各組豚鼠用藥前后ABR反應(yīng)閾見(jiàn)表1，四組動(dòng)物用藥前ABR反應(yīng)閾差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；用藥10天后GM組ABR反應(yīng)閾明顯升高，與用藥前及對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明慶大霉素耳毒性致聾動(dòng)物模型造模成功；用藥后GM+TMP組ABR反應(yīng)閾較GM組明顯降低(P<0.05)。

表1 各組豚鼠用藥前后ABR閾值比較

注：▲與同組用藥前比較，P<0.01；△與正常對(duì)照組比較，P<0.01；*與GM組比較，P<0.01

2.2各組豚鼠耳蝸組織MDA含量 給藥10天后，GM組耳蝸組織中MDA含量顯著升高，與正常對(duì)照組、GM+TMP組、TMP組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。GM+TMP組、TMP組與正常對(duì)照組之間耳蝸MDA含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.3各組豚鼠耳蝸SOD、SOD1、SOD2含量 給藥10天后，GM+TMP組與TMP組耳蝸組織中T-SOD活性明顯高于GM組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GM組T-SOD活性低于對(duì)照組(P<0.05)。GM組耳蝸組織中SOD1活性明顯下降，且與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，GM+TMP組耳蝸組織中SOD1、SOD2活性明顯高于GM組(P<0.05)(表2)。

表2 各組豚鼠耳蝸組織中MDA含量及T-SOD、SOD1、SOD2活性比較

注：△與正常對(duì)照組相比，P<0.05；*與GM組相比，P<0.05

3 討論

氨基糖苷類藥物致聾的主要原因之一是耳蝸毛細(xì)胞的喪失，其致聾機(jī)理之一是耳蝸細(xì)胞內(nèi)氧自由基的過(guò)量產(chǎn)生，通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性，損傷細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡和死亡[3，4]。SODs是體內(nèi)最主要和最常見(jiàn)的抗氧化系統(tǒng)，包括SOD1、SOD2、SOD3，SOD可歧化超氧陰離子自由基生成過(guò)氧化氫，從而消除超氧陰離子自由基的毒性及對(duì)生物膜的降解，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。因此，SOD活性的高低可間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。

有研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用慶大霉素等氨基糖苷類抗生素后，內(nèi)耳血流減少及隨后的再灌注損傷，基底膜過(guò)度振動(dòng)導(dǎo)致局部組織機(jī)械損傷，這些過(guò)程中均有大量自由基產(chǎn)生，清除自由基的酶及其代謝產(chǎn)物的消耗，均可誘導(dǎo)耳蝸毛細(xì)胞的凋亡[5]。本研究結(jié)果顯示，單獨(dú)注射GM 10天后，豚鼠ABR反應(yīng)閾明顯升高，豚鼠耳蝸組織中T-SOD、SOD1活性均低于正常(P<0.05)，表明機(jī)體清除自由基的能力下降，氧自由基含量增多；氧自由基及其派生物可攻擊生物膜中的不飽和脂肪酸，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物MDA含量的明顯升高(P<0.05)，這表明氧自由基增多及其引發(fā)的脂質(zhì)氧化參與了GM的毒性作用。

川芎嗪是中藥川芎的有效成分，化學(xué)結(jié)構(gòu)為四甲基吡嗪(TMP),可通過(guò)血液、耳蝸外淋巴液及腦脊液3種途徑直接作用于耳蝸和聽神經(jīng)[6]。藥理研究證實(shí)[7]，川芎具有抑制自由基產(chǎn)生、提高內(nèi)源性超氧化物歧化酶活性、清除自由基、改善血液流變學(xué)、抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用等藥理作用。本實(shí)驗(yàn)中GM和川芎嗪聯(lián)合使用10天后，豚鼠ABR反應(yīng)閾較GM組明顯降低(P<0.01)，SOD1、SOD2活力明顯增強(qiáng)(P<0.05)，MDA的含量顯著減少(P<0.05),充分說(shuō)明TMP能有效提高SOD的活力，減少脂質(zhì)過(guò)氧化物及終產(chǎn)物MDA的生成，保護(hù)耳蝸組織免受GM的毒性破壞。另外，目前研究認(rèn)為[8,9]Bcl-2定位于線粒體，而Bax定位于胞質(zhì)，死亡信號(hào)啟動(dòng)后Bax從胞質(zhì)易位到線粒體膜上與Bcl一2形成異源二聚體或自身形成同源二聚體。當(dāng)線粒體膜上Bcl一2家族同源二聚體多于異源二聚體時(shí)，線粒體膜通透性孔道開放并釋放相應(yīng)物質(zhì)，激發(fā)線粒體途徑促使細(xì)胞凋亡或壞死。因此有作者認(rèn)為Bcl一2具有抗氧化作用并可通過(guò)抑制活性氧形成而抑制細(xì)胞凋亡[6]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，針刺加川芎可通過(guò)抑制 Bax蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白表達(dá)，從而達(dá)到對(duì)耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用[2]。因此推測(cè)，TMP能夠通過(guò)降低MDA 含量，增強(qiáng)Bcl一2的表達(dá)，從而提高SOD活性，抑制自由基的產(chǎn)生，以對(duì)抗氨基糖苷類藥物對(duì)耳蝸造成的損傷。

綜上所述，TMP可通過(guò)提高耳蝸組織內(nèi)SOD的活力，以防止脂質(zhì)過(guò)氧化，從而減輕急性氨基糖苷類藥物的耳毒性，但TMP是否有直接的氧自由基清除作用及SOD活性的變化是否源于上游因子調(diào)控，仍需進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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