劉永澤 周函△ 錢曉云 朱光潔 羅熠 李奇峰 陳杰 馬登濱 高下

基因治療所用載體分為病毒載體和非病毒載體兩類，目前重組病毒是最有效的基因轉(zhuǎn)染載體，但存在諸多問題，比如免疫原性不能重復(fù)給予、染色體整合或重組、潛在致癌效應(yīng)、毒性、對(duì)所載DNA大小有限制以及制造困難等，限制了其進(jìn)一步應(yīng)用，特別是病毒載體臨床試驗(yàn)期間的致癌及致死事件，引起了廣泛注意，這些風(fēng)險(xiǎn)使得其在臨床應(yīng)用成為一大難題[1]。聚合物載體的一些優(yōu)勢(shì)(安全性高、易生產(chǎn)、可載較大基因、容易修飾等)使得其成為可能的替代物，聚乙烯亞胺(polyethylenimine, PEI) 作為陽(yáng)離子多聚物的一種，已被證明是一種體內(nèi)外均有效的非病毒載體，其轉(zhuǎn)染效率比其它陽(yáng)離子聚合物高，新合成的陽(yáng)離子聚合物的轉(zhuǎn)染效率大多需要參考PEI作比較。本研究以25 kDa線性PEI(linear PEI,L-PEI)或分枝PEI(brcmched PEI,B-PEI)與質(zhì)粒pEGFP-C1在0.1 M PBS溶液或者5%葡萄糖溶液中形成納米粒子，通過293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)選用最合適的轉(zhuǎn)染條件再用于轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的新生小鼠耳蝸基底膜，觀察其轉(zhuǎn)染效果。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只出生后4天(P4)的C57BL/6J小鼠(南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，動(dòng)物飼養(yǎng)按照南京大學(xué)及鼓樓醫(yī)院的規(guī)定執(zhí)行。

1.2主要材料 pEGFP-C1質(zhì)粒(Clontech)， 25 kDa B-PEI (Sigma-Aldrich)，25 kDa L-PEI (Polysciences)，MTT[3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑嗅鹽，噻唑藍(lán)] (Sigma)，DMSO(二甲基亞砜)(Sunshine)，293T細(xì)胞(本實(shí)驗(yàn)室凍存)，高糖DMEM (Hyclone)，F(xiàn)BS (蘭州民海)，100×谷氨酰胺 (Gibco)，0.1 M PBS、5%葡萄糖(上海生工)，酶標(biāo)儀 (BioTek Instruments)，透射電鏡 (JEM-200CX，JEOL)，熒光顯微鏡 (Nikon)，流式儀 (FACS Calibur)，解剖顯微鏡 (Zoom645，COIC)，尖鑷、精細(xì)剪刀 (上海醫(yī)療儀器)，眼科鑷、眼科剪 (蘇州醫(yī)療儀器)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1納米粒子的制備及透射電鏡觀察 根據(jù)Boussif的經(jīng)典方法制備pEGFP-C1 - B/L-PEI納米粒子[2]，分別預(yù)配制1 μg/μl L-PEI、1 μg/μl B-PEI；將2 μg質(zhì)粒加入一預(yù)加50 μl 1×PBS的1.5 ml EP管，再將14 μg L-PEI加入另一1.5 ml EP管；將裝有PEI的EP管內(nèi)液體吸出，緩慢逐滴加入質(zhì)粒管，然后立即渦旋30秒形成納米復(fù)合物后靜置20～30 min，滴加一滴于銅網(wǎng)上，負(fù)染并干燥10～15 min，裝入透射電鏡觀察。

1.3.2凝膠阻滯實(shí)驗(yàn) 納米粒子的制備同上實(shí)驗(yàn)，質(zhì)粒用量均為2 μg，PEI用量范圍為0～4 μg，并行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.3MTT毒性實(shí)驗(yàn) 按照ATCC的方法進(jìn)行293T細(xì)胞培養(yǎng)。0.25%胰酶消化，計(jì)數(shù)后以每孔約10 000個(gè)細(xì)胞種入已預(yù)加無(wú)血清培養(yǎng)液180 μl的96孔板，培養(yǎng)22～26 h。分別用B/L-PEI、pEGFP-C1 - B/L-PEI納米粒加入每孔。B-PEI每孔用量0，0.5，1，1.5，2，3，5，7，10 μl/孔，PBS補(bǔ)足20 μl，每個(gè)濃度組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。L-PEI各組同樣設(shè)定。對(duì)于pEGFP-C1-B-PEI，先以B-PEI每管用量0，2.5，5，7.5，10，15，25，35，50 μl補(bǔ)以PBS制備納米復(fù)合物，然后每孔加20 μl，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔。pEGFP-C1-L-PEI各組同樣設(shè)定。4小時(shí)后換180 μl 培養(yǎng)液，然后加入20 μl 5 mg/ml MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]，4小時(shí)后用槍吸盡每孔中的溶液，加入150 μl DMSO，振搖15 min。以570 nm為測(cè)量波長(zhǎng)，610 nm為參考波長(zhǎng)測(cè)定吸光值。細(xì)胞活力計(jì)算公式為(試驗(yàn)孔-調(diào)零孔)/(空白孔-調(diào)零孔)×100%。

1.3.4pEGFP-C1-L-PEI納米粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞 常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，培養(yǎng)長(zhǎng)到70%～80%時(shí)，胰酶消化，5×104個(gè)細(xì)胞/孔種于24孔板。再次長(zhǎng)到75%左右時(shí)，換400 μl無(wú)血清培養(yǎng)液。按照之前的方法制備100 μl 納米復(fù)合物，加入每孔，孵箱中放置5 h，再換為含血清培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染前30分鐘、轉(zhuǎn)染后24小時(shí)及48小時(shí)用熒光鏡觀察或收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度后行流式上機(jī)檢測(cè)。

1.3.5納米粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠基底膜 本實(shí)驗(yàn)共重復(fù)4次，每次使用12只小鼠。每次實(shí)驗(yàn)將12只P4小鼠冰上麻醉后，皮膚消毒，在超凈臺(tái)內(nèi)斷頭后剪開頂骨并清除腦組織以充分暴露顱底，用細(xì)鑷于內(nèi)耳道處分離暴露耳蝸底回。取出整個(gè)耳蝸，在Hanks平衡液中用游絲鑷打開耳蝸殼，暴露膜迷路，去掉蝸軸及螺旋韌帶、血管紋等其他結(jié)構(gòu)，在放大25～40倍的解剖顯微鏡下用游絲鑷分離取出全耳蝸基底膜。將基底膜移入預(yù)裝有培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后將樣品在膠原凝膠滴的表面鋪放平整，培養(yǎng)皿中預(yù)先滴入20 μl新鮮配制的鼠尾膠(鼠尾膠的配制是在臨用前將9 份含有0.02 M乙酸和50×Collagen溶液，1份10×Basal Medium Eagle溶液，和1份2%碳酸鈉溶液按比例混合制成)，在室溫下放置30分鐘直至鼠尾膠凝膠[3]。然后在每個(gè)培養(yǎng)皿中加入500 μl培養(yǎng)液。將培養(yǎng)皿移入37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)36 h。吸凈培養(yǎng)液，加入新鮮配制的納米復(fù)合物粒子轉(zhuǎn)染5 h，之后再換回原培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染前30分鐘及轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h、48 h分別進(jìn)行免疫熒光觀察。

1.3.6轉(zhuǎn)染后小鼠耳蝸基底膜免疫熒光染色 終止實(shí)驗(yàn)時(shí)向培養(yǎng)皿中加入4%多聚甲醛并在4℃冰箱中固定。0.1 M PBST漂洗后浸入含0.25% TritonX-100溶液破膜，再用0.1 M PBST漂洗后5%BSA封閉，1:200稀釋抗小鼠神經(jīng)絲蛋白抗體NF200，4℃濕盒孵育過夜。第二天以相應(yīng)二抗及Topro共孵育，濕盒避光，室溫兩小時(shí)。0.1 M PBST漂洗后封片，Leica激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 9.2，各實(shí)驗(yàn)組行單項(xiàng)方差分析后，再行SNK-Q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1pEGFP-C1-PEI納米粒子的透射電鏡觀察結(jié)果 在0.1 M PBS中制備的pEGFP-C1-PEI納米粒子多為類球形，pEGFP-C1-L-PEI納米粒直徑約30～100 nm，pEGFP-C1-B-PEI納米粒直徑約70～100 nm(圖1)。

圖1 pEGFP-C1-PEI納米粒子透射電鏡觀察

2.2凝膠阻滯結(jié)果 無(wú)論在0.1 M PBS還是5%葡萄糖溶液中，B-PEI在用量達(dá)0.5 μg時(shí)就可與2 μg質(zhì)粒有相當(dāng)強(qiáng)的結(jié)合，L-PEI在PBS中也能產(chǎn)生較強(qiáng)的阻滯效應(yīng)；但在5%葡萄糖中制備時(shí)，用量需達(dá)1.5 μg才能有一定的阻滯作用，即便如此，使用更高量時(shí)，仍不能完全阻滯。B-PEI在使用較高量時(shí)，會(huì)與DNA結(jié)合相當(dāng)牢固，溴化乙錠(ethidium bromide，EB)無(wú)法插入，因此孔內(nèi)看不到熒光(圖2)。

圖2 L-PEI在PBS中對(duì)pEGFP-C1質(zhì)粒的阻滯效應(yīng)

2.3MTT毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ①載體L-PEI在PBS中對(duì)293T細(xì)胞無(wú)明顯毒性(P>0.05)，而載體B-PEI在PBS中對(duì)293T有細(xì)胞毒性，且呈劑量依賴性，在很高濃度B-PEI，細(xì)胞活性明顯下降(P<0.05)。②載體L-PEI在5%葡萄糖中對(duì)293T細(xì)胞存在毒性，且呈劑量依賴性(P<0.05)，但在最高測(cè)試濃度毒性反而不明顯，細(xì)胞活性與對(duì)照組相反(P>0.05)，載體B-PEI在5%葡萄糖中對(duì)293T細(xì)胞不僅存在毒性，而且細(xì)胞毒性提升很快(P<0.05)(圖3a)。③pEGFP-C1-L-PEI納米粒子在PBS中制備時(shí)，隨著L-PEI用量的增加，細(xì)胞活性無(wú)明顯下降(P>0.05)；而pEGFP-C1-B-PEI納米粒子在PBS中制備時(shí)，形成的納米粒子降低了B-PEI本身的毒性，在用量增加時(shí)，細(xì)胞活性下降(P<0.05)。④pEGFP-C1-L-PEI納米粒子在5%葡萄糖溶液中制備時(shí)，隨著L-PEI用量增加，毒性還是很明顯(P<0.05)。pEGFP-C1-B-PEI納米粒子在5%葡萄糖中制備后對(duì)293T細(xì)胞存在細(xì)胞毒性，而且細(xì)胞毒性的提升比只加載體時(shí)緩慢許多，在高B-PEI用量時(shí)，活性顯著下降(P<0.05)(圖3b)。因此，無(wú)論是L-PEI載體本身，還是其與質(zhì)粒pEGFP-C1形成的納米粒子，在PBS中對(duì)293T細(xì)胞的細(xì)胞毒性均為四種中最低。

2.4pEGFP-C1-L-PEI納米粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光觀察及流式分析 依據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在PBS中制備pEGFP-C1-L-PEI納米粒子。pDNA用量為2 μg，L-PEI用量范圍為2～14 μg，在L-PEI用量達(dá)7 μg時(shí)，流式測(cè)定轉(zhuǎn)染效率已達(dá)81.54%±2.32%，繼續(xù)增加用量不能顯著提高轉(zhuǎn)染效率(圖4)。

2.5pEGFP-C1 - L-PEI納米粒子轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠基底膜熒光觀察 當(dāng)L-PEI用量達(dá)4 μg后，開始出現(xiàn)轉(zhuǎn)染，主要轉(zhuǎn)染部位位于螺旋緣的纖維細(xì)胞，螺旋緣的纖維細(xì)胞表達(dá)綠色熒光的時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)一周。在L-PEI用量達(dá)5～14 μg的條件下，支持細(xì)胞所在部位出現(xiàn)綠色熒光，表達(dá)時(shí)間較短，多不超過72小時(shí)。螺旋神經(jīng)元出現(xiàn)綠色熒光的樣品多為L(zhǎng)-PEI用量達(dá)10 μg及以上，表達(dá)時(shí)間亦短于72小時(shí)(圖5)。

2.6轉(zhuǎn)染后小鼠耳蝸基底膜組織不同部位免疫熒光染色結(jié)果 體外培養(yǎng)三天的新生小鼠耳蝸基底膜仍能維持較好的形態(tài)(圖6a)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，行免疫熒光染色后，可以明確螺旋緣中的纖維細(xì)胞、螺旋神經(jīng)元、支持細(xì)胞被轉(zhuǎn)染。根據(jù)被轉(zhuǎn)染的支持細(xì)胞的形態(tài)和位置推測(cè)，Hensen細(xì)胞最有可能被轉(zhuǎn)染(圖6b～d)。另外，前庭膜上的多邊形上皮細(xì)胞也有少許被轉(zhuǎn)染。

圖3 PEI載體和pEGFP-C1-PEI納米粒子對(duì)293T細(xì)胞的毒性測(cè)試

a：不同濃度的PEI載體對(duì)293T細(xì)胞的毒性；b不同比例復(fù)合形成的pEGFP-C1-PEI納米粒子對(duì)293T細(xì)胞的毒性(*P>0.05；**P<0.05)

圖4 pEGFP-C1-L-PEI納米粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(5 μg L-PEI: 2 μg pEGFP-C1)

3 討論

PEI可作為非病毒基因載體介導(dǎo)DNA[2]、RNA[4,5]、寡核苷酸轉(zhuǎn)染[2,6]，由于其轉(zhuǎn)染效率比之前研究的DEAE-dextran、polylysine、polyberene、Ca3(PO4)2等要高出很多，很大程度上推動(dòng)了非病毒載體的發(fā)展。PEI是一種帶有很高正電荷的聚陽(yáng)離子，一、二、三級(jí)胺基基團(tuán)的比例為1：2：1，每三個(gè)原子就是一個(gè)可以質(zhì)子化的氮原子，而在生理pH條件下僅15%～20%氮原子發(fā)生質(zhì)子化[7]。在較廣的范圍內(nèi)(例如低于生理pH時(shí))，PEI能改變其離子化狀態(tài)來實(shí)現(xiàn)緩沖，結(jié)合DNA后，每2～3個(gè)氨基氮有一個(gè)發(fā)生質(zhì)子化。PEI所帶的正電荷可與DNA磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷發(fā)生相互作用，DNA被壓縮，兩者變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)緊湊的納米復(fù)合物粒子，呈環(huán)形或球形結(jié)構(gòu)[8]。傅里葉變幻紅外光譜證明復(fù)合后DNA保留B型構(gòu)象[9]。

圖5 pEGFP-C1 - L-PEI納米粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的小鼠基底膜熒光觀察

a：正常培養(yǎng)36小時(shí)的基底膜組織(底回)，轉(zhuǎn)染前30分鐘，形態(tài)良好，無(wú)任何綠色熒光；b：轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，可見支持細(xì)胞區(qū)域出現(xiàn)綠色熒光(紅色箭頭)，極少數(shù)神經(jīng)元也被轉(zhuǎn)染(白色箭頭)。c：轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，可見主要轉(zhuǎn)染部位位于螺旋緣的纖維細(xì)胞(藍(lán)色箭頭)。a、b、c中上三張圖示綠色激發(fā)光下所見，下三張圖示光鏡下所見。上下兩張圖代表同一視野

圖6 轉(zhuǎn)染前后小鼠耳蝸基底膜免疫熒光染色結(jié)果

a：轉(zhuǎn)染前體外培養(yǎng)三天小鼠耳蝸基底膜；b:轉(zhuǎn)染后48 h螺旋緣內(nèi)的纖維細(xì)胞；c:轉(zhuǎn)染后48 h螺旋神經(jīng)元，胞體較小的2型神經(jīng)元被轉(zhuǎn)染；d：轉(zhuǎn)染后48 h支持細(xì)胞，扁平條狀，類似Hensen細(xì)胞的表面形態(tài)。 (標(biāo)尺：a：40 μm；b～d：20 μm)

在細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)，硫酸化氨基葡聚糖可與納米復(fù)合物作用，使后者入胞，但也可使DNA被釋放，僅空載體入胞[10]。PEI-pDNA形成的納米復(fù)合物主要通過胞吞或胞飲方式進(jìn)入早期繼而晚期內(nèi)含體，然后進(jìn)入溶酶體。PEI具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，在內(nèi)含體-溶酶體內(nèi)，通過結(jié)合大量質(zhì)子，引起氯離子內(nèi)流，滲透壓上升導(dǎo)致水進(jìn)入，最終引起內(nèi)含體-溶酶體破裂，納米復(fù)合物和游離的PEI釋放進(jìn)入胞質(zhì)[11]，從而PEI不需破膜劑來幫助其與質(zhì)粒等形成的納米粒從內(nèi)含體-溶酶體中逃逸。胞質(zhì)內(nèi)存在的蛋白、微管、細(xì)胞器阻礙粒子的運(yùn)動(dòng)，裸質(zhì)粒在胞質(zhì)中移動(dòng)非常緩慢[12]，帶正電的納米?？梢匝貛ж?fù)電的微管或馬達(dá)蛋白移動(dòng)，或依賴自然情況下的內(nèi)含體-溶酶體沿微管的移動(dòng)而移動(dòng)，減數(shù)分裂時(shí)也能被重分布[13]。納米復(fù)合物接近核膜后，由于缺乏類似病毒的入核機(jī)制，轉(zhuǎn)染分裂期細(xì)胞比剛開始細(xì)胞周期的細(xì)胞更容易。

Boussif等[2]一開始研究的是分子量為750 kDa的分枝PEI，體內(nèi)應(yīng)用時(shí)毒性較大已被淘汰，之后發(fā)展出許多新的低分子量或不同結(jié)構(gòu)的PEI，以25 kDa分枝PEI、25 kDa線性PEI為代表[14]。制備納米復(fù)合物的溶劑多選用5%葡萄糖或者150 mM NaCl。本研究中利用0.1 M PBS和5%葡萄糖溶液分別和不同濃度的PEI制備納米粒子行凝膠阻滯，結(jié)果B-PEI在使用較高量時(shí)EB無(wú)法插入，孔內(nèi)看不到熒光，而L-PEI在PBS中對(duì)pEGFP-C1質(zhì)粒的阻滯效果較為理想，這與其他研究的結(jié)果類似[15,16]，但這些研究大多測(cè)定的是在某一種介質(zhì)如150 mM NaCl中制備的樣品且多僅提供某一種PEI的阻滯結(jié)果。以5%葡萄糖為溶劑時(shí)，無(wú)論B-PEI還是L-PEI，均可制備出粒徑較小且較為均一的納米粒子，粒徑隨所用PEI的種類和分子量以及DNA與PEI的用量比有關(guān)[17]；無(wú)鹽溶液中制備的納米粒，在加入鹽溶液后會(huì)發(fā)生聚集作用[18]。本研究采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)使用的緩沖溶液1×PBS，是為了模擬外淋巴液中較復(fù)雜的離子成分和溶液中的離子強(qiáng)度[19]，并且已有用Tris緩沖液作為溶劑來制備納米復(fù)合物的報(bào)道[20]。

本研究首次證明非病毒載體L-PEI既可以轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞或毛細(xì)胞，又可以轉(zhuǎn)染螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，雖然轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞所用的最優(yōu)L-PEI用量與質(zhì)粒的用量比可能不一致，仍將推進(jìn)非病毒載體在耳科的研究，因?yàn)?，不僅該方向的研究極少，而且之前在葡萄糖系統(tǒng)中制備的22 kDa L-PEI并未成功轉(zhuǎn)染支持細(xì)胞和/或毛細(xì)胞及兩者的前體細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(這些是耳科基因治療的靶細(xì)胞)，這可能與Tan等[21]選擇的氮磷比(N/P)比較低有關(guān)。

本研究證明，相對(duì)于B-PEI，L-PEI提供了更好的轉(zhuǎn)染效果，在緩沖系統(tǒng)例如PBS中制備L-PEI-pDNA納米粒不僅比150 mM NaCl優(yōu)越，而且比5%葡萄糖溶液制備的也要優(yōu)越，以適宜比例范圍的質(zhì)粒及L-PEI用量可以轉(zhuǎn)染新生小鼠耳蝸基底膜的細(xì)胞。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以人工外淋巴液或內(nèi)淋巴液為溶劑制備納米復(fù)合物，觀察其作為介質(zhì)是否會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)染產(chǎn)生影響及在人工外淋巴液中制備后再轉(zhuǎn)入內(nèi)淋巴液環(huán)境時(shí)納米復(fù)合物性質(zhì)是否會(huì)有所改變。借助電鏡，還將進(jìn)一步追蹤納米粒及L-PEI在體外培養(yǎng)小鼠內(nèi)耳基底膜的組織細(xì)胞定位。

分枝和線性PEI-pDNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力不同，線性PEI更高的效率可能是由于組織對(duì)25 kDa L-PEI的耐受力強(qiáng)于B-PEI以及鹽條件下不穩(wěn)定的內(nèi)在動(dòng)能。了解如何充分利用此機(jī)理，可以以更大的靈活性和體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率來幫助設(shè)計(jì)未來的載體[14]；聚合物非病毒載體領(lǐng)域在耳科的應(yīng)用才剛起始，并且值得深入研究；高通量合成及篩選法為更快尋找更好的非病毒載體提供了可能[22]。

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