馬海珠 鐘時(shí)勛 溫雅

梅尼埃病是一種慢性水代謝性內(nèi)耳疾病，目前普遍認(rèn)為該病的組織病理學(xué)特征為內(nèi)淋巴積水，為內(nèi)淋巴液過(guò)度分泌和/或吸收障礙引起內(nèi)淋巴液穩(wěn)態(tài)失衡所致[1，2]。Takeda等[3]發(fā)現(xiàn)梅尼埃病患者的血漿精氨酸加壓素(arginine vasopressin, AVP)水平比其他原因所致眩暈的患者明顯增高，豚鼠皮下埋置微泵，持續(xù)小劑量注入AVP后發(fā)現(xiàn)豚鼠耳蝸底回、中回以及頂回輕-中度內(nèi)淋巴積水[4]，由此推測(cè)內(nèi)淋巴積水可能與血漿AVP的異常分泌有關(guān)。水通道蛋白2(aquaporin 2，AQP2)表達(dá)于腎、耳蝸[5]、內(nèi)淋巴囊上皮[2]、腦以及睪丸[5]等組織，是唯一對(duì)AVP敏感的蛋白通道，AVP上調(diào)腎臟集合管主細(xì)胞頂側(cè)膜AQP2的表達(dá)，促進(jìn)集合管腔水的重吸收。然而，AVP對(duì)耳蝸AQP2表達(dá)的調(diào)節(jié)及機(jī)制尚未完全闡明。本研究擬通過(guò)腹腔注射AVP的V2受體激動(dòng)劑醋酸去氨加壓素(deamino arginine vasopressin, DDAVP)構(gòu)建內(nèi)淋巴積水豚鼠模型[6]，分析DDAVP對(duì)豚鼠耳蝸AQP2的分布與表達(dá)的影響，探討AQP2參與內(nèi)淋巴積水的形成機(jī)制，為治療梅尼埃病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只普通級(jí)健康雄性成年豚鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物管理符合重慶市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定)，體重200～250 g，活動(dòng)敏捷，無(wú)噪聲暴露及藥物使用史，耳廓反射靈敏。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各20只。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)材料 DDAVP購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；AQP2兔抗鼠多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Crus公司；兔鼠通用型SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2.2構(gòu)建內(nèi)淋巴積水豚鼠模型 實(shí)驗(yàn)組腹腔注射DDAVP 4μg·kg-1·d-1，共7天，構(gòu)建內(nèi)淋巴積水模型；對(duì)照組每日給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射，共7天。

1.2.3耳蝸及腎臟切片HE染色[6]停藥7天后，隨機(jī)抽取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠各5只(10耳)，全身麻醉下進(jìn)行心臟灌注后斷頭，打開聽泡，修剪耳蝸周圍骨質(zhì)，將耳蝸置于4%多聚甲醛固定48小時(shí)，10%EDTA脫鈣液(pH 7.0～7.2)在4℃下脫鈣3周，梯度酒精逐級(jí)脫水，石蠟包埋，平行蝸軸連續(xù)切片，片厚4 μm。取出腎臟，固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色。運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)定耳蝸切片各回中階和前庭階橫截面積，計(jì)算中階與中階加前庭階橫截面積和的比值，取平均值R代表內(nèi)淋巴積水程度[6]。

1.2.4免疫組化染色 將上述切片按照SP免疫組化試劑盒說(shuō)明書操作，一抗為AQP2兔抗鼠多克隆抗體，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，腎臟切片為陽(yáng)性對(duì)照。免疫組化染色棕色顆粒為AQP2染色的陽(yáng)性標(biāo)志，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算平均光密度值(OD值)。

1.2.5蛋白印跡法 將兩組剩余豚鼠各15只(30耳)全身麻醉，斷頭取出聽泡，骨鑷剔除骨性外壁，保留耳蝸軟組織，以3對(duì)耳蝸(6耳)作為一組，提取蛋白，12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗為AQP2兔抗鼠多克隆抗體，β-actin為自身對(duì)照，腎臟為陽(yáng)性對(duì)照。運(yùn)用Quantity One軟件計(jì)算AQP2與β-actin蛋白條帶的灰度值比值，以該比值作為AQP2蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量比較。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1內(nèi)淋巴囊積水模型評(píng)估 兩組豚鼠的腎臟組織未見明顯充血水腫。實(shí)驗(yàn)組豚鼠(5只，10耳)耳蝸切片HE染色顯示前庭膜向前庭階膨隆，且底回較頂回更明顯，部分前庭膜破裂，均表現(xiàn)為不同程度的內(nèi)淋巴積水，耳蝸切片顯示造模成功率為100%；對(duì)照組豚鼠(5只，10耳)耳蝸前庭階、鼓階等組織結(jié)構(gòu)正常，鼓階面積約為前庭階面積的二分之一，均無(wú)明顯內(nèi)淋巴積水(圖1)。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組R值分別為0.42±0.04和0.31±0.03，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)淋巴積水程度重于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組豚鼠耳蝸AQP2表達(dá)部位及OD值比較 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組豚鼠耳蝸組織中均有AQP2表達(dá)(圖2)，表達(dá)部位均位于血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組血管紋AQP2表達(dá)的平均OD值分別為0.1611±0.0037和0.1356±0.0108，實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組耳蝸AQP2表達(dá)半定量比較 蛋白印跡法結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組耳蝸均有AQP2表達(dá)(圖3)。以β-actin的表達(dá)作為自身對(duì)照，將AQP2與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為AQP2蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行半定量比較，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組AQP2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.9554±0.0498和0.7664±0.1452，實(shí)驗(yàn)組耳蝸AQP2的蛋白表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

目前，國(guó)內(nèi)外構(gòu)造內(nèi)淋巴積水動(dòng)物模型的方法有很多，最常用的經(jīng)典方法為手術(shù)栓塞內(nèi)淋巴囊法，也有人用激素誘導(dǎo)法和免疫毒素法。本實(shí)驗(yàn)采用腹腔注射DDAVP法[6]建模，成功誘發(fā)豚鼠內(nèi)耳內(nèi)淋巴積水，該方法較手術(shù)法操作簡(jiǎn)單易行，觀察周期短，較其他造模方法成功率高，可行性強(qiáng)。從文中結(jié)果看，豚鼠內(nèi)耳底回積水較頂回明顯，考慮可能為耳蝸底回螺旋韌帶等膜迷路組織表面積大于頂回，其所包含的與AVP作用的酶及受體相對(duì)較多有關(guān)。天然AVP的長(zhǎng)效衍生物DDAVP為AVP的V2受體激動(dòng)劑，特異性作用于V2受體，強(qiáng)化了抗利尿作用，延長(zhǎng)了作用時(shí)間，減輕了升壓作用，排除了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因血壓升高等病理改變對(duì)結(jié)果的干擾；文中結(jié)果間接表明AVP可以通過(guò)作用于V2受體誘導(dǎo)內(nèi)淋巴積水。

圖1 兩組豚鼠耳蝸內(nèi)淋巴積水(HE ×100) a 實(shí)驗(yàn)組，b 對(duì)照組

圖2 兩組豚鼠血管紋及螺旋神經(jīng)節(jié)AQP2表達(dá)(DAB染色 ×200)

圖3 蛋白印跡法檢測(cè)兩組豚鼠耳蝸AQP2蛋白表達(dá)

左側(cè)為實(shí)驗(yàn)組，右側(cè)為對(duì)照組，兩組豚鼠耳蝸均有AQP2蛋白的表達(dá)(28 kDa)，β-actin作為內(nèi)參照(42 kDa)

目前，關(guān)于AQP2在耳蝸的表達(dá)部位眾說(shuō)紛紜。Mhatre等[5]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色方法發(fā)現(xiàn)在成年大鼠和小鼠AQP2表達(dá)于內(nèi)耳內(nèi)淋巴周圍的組織，包括Reissner膜、Corti器、內(nèi)外溝細(xì)胞，而血管紋未見表達(dá)。Merves[7]發(fā)現(xiàn)AQP2表達(dá)于小鼠內(nèi)耳的Reissner膜、Corti器和血管紋。本研究發(fā)現(xiàn)AQP2表達(dá)于豚鼠耳蝸的血管紋、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，與國(guó)內(nèi)學(xué)者韓紅蕾等[6]研究結(jié)果相似。推測(cè)耳蝸AQP2的表達(dá)差異與動(dòng)物種屬差異有關(guān)，也可能與不同的實(shí)驗(yàn)方法有關(guān)。

Sawada[8]給予大鼠大劑量AVP(50 μg/kg)，發(fā)現(xiàn)大鼠耳蝸AQP2 mRNA表達(dá)顯著增加，本研究結(jié)果顯示給予DDAVP后，豚鼠耳蝸中AQP2表達(dá)強(qiáng)度高于正常豚鼠，組織學(xué)特征為內(nèi)淋巴積水，提示DDAVP可上調(diào)豚鼠耳蝸AQP2的表達(dá)誘發(fā)內(nèi)淋巴積水。Nishioka[9]發(fā)現(xiàn)在大鼠內(nèi)耳中AVP上調(diào)AQP2及V2受體表達(dá)，同時(shí)免疫電鏡顯示血管紋中AQP3和V2受體表達(dá)于基底細(xì)胞的頂側(cè)膜，AQP2定位于底側(cè)膜，這與其在腎臟的分布方式相同，因此推測(cè)AQP2、AQP3和V2受體在血管紋中的作用機(jī)制與在腎臟中相同，水分子經(jīng)血管紋基底細(xì)胞底側(cè)膜上AQP2水通道從外淋巴流入基底細(xì)胞，通過(guò)基底細(xì)胞頂側(cè)膜上AQP3水通道進(jìn)入內(nèi)淋巴，實(shí)現(xiàn)內(nèi)、外淋巴液的動(dòng)態(tài)平衡，共同維持內(nèi)耳正常的聽覺(jué)和前庭功能[1]。結(jié)合本研究結(jié)果及文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)DDAVP誘發(fā)內(nèi)淋巴積水的機(jī)制可能為DDAVP通過(guò)螺旋動(dòng)脈結(jié)合血管紋基底細(xì)胞頂側(cè)膜上V2受體，上調(diào)血管紋底側(cè)膜上AQP2的表達(dá)，增加基底細(xì)胞底側(cè)膜上AQP2分布的密度，促進(jìn)水經(jīng)AQP2水通道從外淋巴流入基底細(xì)胞，通過(guò)基底細(xì)胞頂側(cè)膜的AQP3進(jìn)入血管紋細(xì)胞外液，導(dǎo)致內(nèi)淋巴液過(guò)度分泌，誘發(fā)內(nèi)淋巴積水。Nishimura[10]使用透射電鏡實(shí)時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腹腔注射VP可誘發(fā)內(nèi)淋巴積水，而V2受體特異性拮抗劑可抑制該作用；Maekawa[11]發(fā)現(xiàn)V2受體特異性拮抗劑和蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)特異性拮抗劑可阻滯AVP對(duì)AQP2的調(diào)控作用，而腺苷酸環(huán)化酶激活劑可產(chǎn)生與AVP類似的作用。因此，推測(cè)DDAVP通過(guò)V2受體-cAMP-PKA途徑作用于AQP2，然而更為具體明確的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

在腎臟集合管主細(xì)胞中，AQP3與V2受體位于底側(cè)膜，AQP2位于頂側(cè)膜，DDAVP上調(diào)AQP2的表達(dá)，位于腎臟的集合管主細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)富含AQP2的囊泡通過(guò)胞吐移位于頂側(cè)膜，且提高AQP2的活性，進(jìn)而提高水通透性，增加從集合管腔重吸收至主細(xì)胞胞質(zhì)的水分，促進(jìn)腎臟重吸收；但在耳蝸組織，DDAVP上調(diào)血管紋AQP2表達(dá)，促進(jìn)血管紋分泌內(nèi)淋巴液，導(dǎo)致內(nèi)淋巴積水；這表明AQP2介導(dǎo)水轉(zhuǎn)運(yùn)具有方向性，可能是因?yàn)樗诙佈芗y和腎臟集合管上皮表達(dá)方向相反所致，具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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