高連祥 胡炎坤 王 瑩 賈海燕 李 霞 任 睿

35例惡性腫瘤患者淋巴細(xì)胞Ag-NORs檢測(cè)分析

高連祥 胡炎坤 王 瑩 賈海燕 李 霞 任 睿

目的細(xì)胞核仁形成區(qū)（NORs）由核糖體RNA基因組成，位于此區(qū)調(diào)控rRNA轉(zhuǎn)錄的酸性非組蛋白可被硝酸銀染色（Ag-NOR），腫瘤細(xì)胞中Ag-NOR數(shù)目、分布和強(qiáng)度可作為腫瘤診斷、細(xì)胞分型和分化分級(jí)的重要指標(biāo)。由于腫瘤細(xì)胞相關(guān)分子等的毒性作用，患者淋巴細(xì)胞NORs區(qū)的酸性非組蛋白得以表達(dá)。有別于非惡性疾病，并以此進(jìn)行腫瘤診斷和病情監(jiān)測(cè)。方法北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司提供的KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)，5%硝酸銀及相應(yīng)的銀染試劑，RPMI1640培養(yǎng)液，普通細(xì)胞銀染技術(shù)對(duì)患者外周血淋巴細(xì)胞染色。選擇35例惡性腫瘤患者及35例健康對(duì)照者，經(jīng)培養(yǎng)、制片、銀染、圖像分析四個(gè)步驟，計(jì)算T淋巴細(xì)胞核銀染面積與細(xì)胞面積比值（即 I.S%值）。結(jié)果對(duì)70例正常者和各種腫瘤患者的淋巴細(xì)胞酸性非組蛋白表達(dá)活性進(jìn)行了對(duì)比研究，發(fā)現(xiàn)惡性疾病與正常者之間有明顯差異。35例腫瘤患者中有28例陽(yáng)性結(jié)果，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明I.S%陽(yáng)性結(jié)果與腫瘤有較密切聯(lián)系，但并無(wú)特異性，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符。結(jié)論外周血T淋巴細(xì)胞Ag-NORs檢測(cè)，可作為惡性腫瘤診斷及病情監(jiān)測(cè)的重要參考指標(biāo)。

KL型圖象分析系統(tǒng)；T淋巴細(xì)胞Ag-NORs檢測(cè)；腫瘤

利用免疫學(xué)方法對(duì)惡性腫瘤患者進(jìn)行診斷、治療和預(yù)后的監(jiān)測(cè)近年來(lái)受到廣泛重視，也是臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展的重要領(lǐng)域之一，T淋巴細(xì)胞是機(jī)體參與抗腫瘤作用的主要免疫細(xì)胞，國(guó)內(nèi)外對(duì)T淋巴細(xì)胞核仁形成區(qū)酸性非組蛋白（Ag-NOR）表達(dá)，研究了Ag-NOR與癌癥的種種關(guān)系。我院2003年3月～2004年 7月對(duì) 35例正常者和 35例癌癥患者的Ag-NOR進(jìn)行觀察并報(bào)告其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料正常者35例為對(duì)照組；住院的腫瘤患者35例作為研究組，具體見(jiàn)表1。

1.2 設(shè)備及試劑設(shè)備使用北京健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)的KL型腫瘤免疫圖像分析系統(tǒng)；試劑由健爾康醫(yī)療設(shè)備有限公司提供的 RPMI-1640培養(yǎng)基、低滲液、銀染液（5%硝酸銀）固定液等配套試劑。

表1 兩組臨床資料比較(n)

1.3 方法①在無(wú)菌條件下取0.5ml抗凝血加到含PHA的RPMIl640培養(yǎng)液的瓶中，放置在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)至 72h；②制片是將培養(yǎng)的細(xì)胞懸液輕輕混勻并吸到5m1離心管中，2000rpm離心5min，棄去上清液后加入 5ml低滲液，充分混勻，加入0.5ml固定液，混勻，離心棄上清液，再加入 5m1固定液并混勻，棄上清液，上述步驟再重復(fù)一次，沉淀中加0.3ml固定液，混勻后取2～3滴滴到預(yù)冷的玻璃片上，晾干；③銀染處理將水浴箱溫度升到80～90℃，上面放置鋁板，鋁板熱后放置滴有細(xì)胞的載坡片，熱后加染液A4滴，染液B2滴，取蓋玻片輕輕放在樣品玻片上，待涂片變成深黃色時(shí)取下，約4min再用凈水沖洗干凈，自然晾干。

1.4 圖像分析將染片置顯微鏡載物臺(tái)上，啟動(dòng)圖像分析程序，計(jì)算30個(gè)T淋巴細(xì)胞核仁銀染面積與細(xì)胞核銀染面積比值（I.S%），見(jiàn)圖1、圖2。

圖1 健康體檢T淋巴細(xì)胞I.S%值

圖2 多發(fā)性骨髓瘤T淋巴細(xì)胞I.S%值

2 結(jié)果

35例正常者I.S%值平均為7.2%，35例腫瘤患者中肝癌6例I.S%值平均為4.50%，肺癌7例I.S%值平均為4.98%，胃腸癌7例I.S%值4.87%，10例其它轉(zhuǎn)移癌I.S%值平均為4.78%，5例存活5年以上無(wú)轉(zhuǎn)移者 I.S%值平均為 6.67%。惡性腫瘤患者總的 I.S%值平均為 4.84%。正常者與惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)P＜0.05，見(jiàn)表2。不同部位的惡性腫瘤的I.S%值無(wú)明顯差異（P＞0.05），見(jiàn)表3。

表2 正常者與惡性腫瘤患者T淋巴細(xì)胞Ag-NORs檢測(cè)結(jié)果

表3 不同腫瘤患者T淋巴細(xì)胞Ag-NORs檢測(cè)結(jié)果

3 討論

細(xì)胞核仁形成區(qū)（NORs）是細(xì)胞周期一定時(shí)期細(xì)胞核中出現(xiàn)環(huán)型卷曲的DNA，主要由 rDNA組成。Ag-NOR為被硝酸銀染色的NORs區(qū)，腫瘤患者免疫活性細(xì)胞中，調(diào)控rRNA合成的酸性非組蛋白的表達(dá)受到相對(duì)特異性抑制，這種抑制在途徑和程序上有別于其它非癌性因素對(duì)免疫系統(tǒng)的抑制；T淋巴細(xì)胞是機(jī)體參與抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要免疫活性細(xì)胞。因此，通過(guò)監(jiān)測(cè)患者T淋巴細(xì)胞核仁形成區(qū)酸性非組蛋白表達(dá)，可以較敏感地反映出患者癌癥的存在和病情狀態(tài)，有利于腫瘤的診斷和病情監(jiān)測(cè)[1-2]。本研究利用KL型圖象分析系統(tǒng)，分析腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞核仁區(qū)酸性非組蛋白轉(zhuǎn)錄活性，研究其在腫瘤診斷、鑒別診斷和病情監(jiān)測(cè)中的意義。

對(duì)正常者及惡性腫瘤患者的檢測(cè)結(jié)果表明，腫瘤患者非組蛋白的表達(dá)明顯降低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有顯著性差異（P＜0.05）。表3中不同部位腫瘤患者間無(wú)明顯差異（P＞0.05），說(shuō)明Ag-NORs檢測(cè)對(duì)任何部位腫瘤患者存在普遍臨床意義。其中手術(shù)后無(wú)轉(zhuǎn)移存活5年以上的患者，結(jié)果說(shuō)明其免疫功能狀態(tài)有了好轉(zhuǎn)。Ag-NORs的檢測(cè)應(yīng)避開(kāi)感染、炎癥及治療過(guò)程。腫瘤在放療中有明顯上升，在放療后又逐步下降，但2～4周趨于穩(wěn)定。這可能與腫瘤放療引起的炎癥有關(guān)，準(zhǔn)確原因有待進(jìn)一步研究。另外，用于高危人群的腫瘤普查有一定的臨床價(jià)值。

[1] 王瑞年.Ag-NOR腫瘤研究的一項(xiàng)新指標(biāo)(綜述)[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(腫瘤分冊(cè)),1995,15(5):22-26.

[2] Crocker J,Paramjit Nar.Nacleoiar crganlzer regions in lymphomas[J]. J Pathology,2000,151:111-118.

The leukomonocyte Ag-NORs Detection and Analysis in 35 Cases Patients with Malignant Neoplastic Disease

Gao Lianxiang Hu Yankun Wang Ying Jia Haiyan Li Xia RenRui

ObjectiveThe nucleolus organizer regions(NORs)are composed by ribosome(RI)RNA genes.Theseregions control and regulate the acor-nonhistone protein transcriptived by rRNA,and also can be stained by argent nitrate (AgNO3)-Ag-NOR.The numbers,distribution and intensity of Ag-NOR in tumor cells(TC)can be used as significant index in the diagnose,cell typing,cell differentiation ranking of tumor.In case of the toxic effects of related molecule in TC,there are some differences in the expression of acor-nonhistone protein in the nucleolus organizer regions(NORs)between the patients with malignant tumor and non-malignant tumor,this can be used as a method of the diagnose of tumor and the monitoring of pathogenetic condition.MethodsThe KL-model image analytical system of tumor immunity was provide by Beijing JIANERKANG medical treatment facility company,Ltd.Other materials included 5%AgNO3 and the proportional silver staining reagent,and the RPMl 640 culture solution.The ordinary silver staining technique was used to stain peripheral-blood lymphocytes of the patients.ResultsThe contrast study of the activity of leukomonocyte acor-nonhistone protein expression were done in 70 health adult and patients with different tumor diseases,and remarkable difference was found between the patients with tumor diseases and health people.28 cases were positive results among 35 cases of tumor patients,which with statistical significance. This indicated the I.S% positive result was comparatively closed relation with tumors.This result is in accordance with some related literature reports.ConclusionThe detection of Ag-NORs of the peripheral-blood T-lymphocytes can be used as an important reference index in the diagnose of malignant tumor and the monitoring of pathogenetic condition.

KL-model image analytical system;The detection of T-leukomonocyte Ag-NORs;Tumor

R730.4

A

1673-5846(2014)01-0159-03

總參工程兵直屬醫(yī)院，北京 100857